Спосіб прогнозування спайкової хвороби очеревини

Реферат: Винахід належить до способу прогнозування спайкової хвороби очеревини шляхом виділення з проби крові дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) і проведення генотипування поліморфізму гена методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), причому виявляють поліморфізм гена ITGA 2 шляхом виділення з лейкоцитів цільної крові геномної ДНК методом ПЛР за допомогою набору реагентів для ампліфікації "SNP-ЕКСПРЕС-РВ", аналіз проводять за допомогою реагенту "ДНК-експрес-кров", і за наявності гетерозиготи СТ або гомозиготи СС прогнозують розвиток спайкової хвороби очеревини. UA 110915 C2 (12) UA 110915 C2 UA 110915 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини, а саме до абдомінальної хірургії, і може бути використаним для прогнозування спайкової хвороби очеревини (СХО). За даними різних авторів більш ніж у 55 % пацієнтів, які перенесли в анамнезі абдомінальне хірургічне втручання, в післяопераційному періоді розвивається спайковий процес черевної порожнини, який здатний привести до такого тяжкого ускладнення як спайкова кишкова непрохідність, а повторні операції збільшують ризик утворення спайок та їх ускладнень [Костырной А.В. Спаечная болезнь брюшины: настоящее и будущее проблемы / А.В. Костырной, К.Л. Гройзик, С.Р. Мустафаева // Таврический медико-биологический вестник. 2013. - Т. 16, № 1-3 (61). - С. 262-267; Диагностика, лечение и профилактика спаечной болезни брюшины / П.К. Холматов, Ш.К. Назаров, Б.Н. Джонов, Ф. Комилов // Вестник Авиценны. - 2012. - № 1 (50). - С. 155-160]. До теперішнього часу поки ще немає достатньо об'єктивних методів прогнозування виникнення післяопераційних спайок в черевній порожнині. У цьому зв'язку особливу актуальність представляє використання прогностичних критеріїв. Широко використовують наступні інтраопераційні фактори, що сприяють утворенню післяопераційних спайок: ішемія, висихання поверхні очеревини, накладення швів, кетгутові або хромовані шви, натяг очеревини, згустки крові, що залишилися в черевній порожнині, тривала операція, використання грубих інструментів при операціях. Наявність цих факторів, а також зовнішній вигляд і протяжність післяопераційного рубця дають можливість в деякій мірі прогнозувати розвиток спайкових ускладнень [Чекмазов И.А. Спаечная болезнь брюшины: руководство / И.А.Чекмазов. - М.: Гэотар-Медиа, 2008. - 160 с.; Запорожец А.А. Причины возникновения спаек брюшины после первичных асептических операций на желудочно-кишечном тракте и метод их профилактики / А.А. Запорожец // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. - 2011. - Т. 170, № 2. - С. 14-20]. Деякі автори вважають, що в патогенезі розвитку спайок головна роль належить спадковій схильності [Магалашвили Р.Д. Диагностика предрасположенности, профилактика и лечение спаечной болезни: автореф. дис. … докт. мед. наук / Р.Д. Магалашвили. - Москва, 1991. - 39 с.]. В цьому напрямку було розроблено спосіб прогнозування спайкової хвороби у дітей, які перенесли оперативні втручання на органах черевної порожнини. Суть винаходу полягає в тому, що з лімфоцитів периферичної венозної крові виділяють дезоксирибонуклеїнову кислоту (ДНК), проводять генотипування поліморфізму NAT2 методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і при виявленні одного з генотипів NAN2*4/*4, NAT2*4/*5, NAT2*4/*6, NAT2*4/*7 прогнозують ризик розвитку спайкової хвороби очеревини у обстежуваного [Пат. № 2269133 Росія, МПК G01N 33/53. Способ прогнозирования спаечной болезни у детей, перенесших оперативные вмешательства на органах брюшной полости / Викторова Т.В., Викторов В.В., Комаров О.А., Макушин А.А., Данилко К.В., Гадельшин Э.С.; ГОУ ВПО БГМУ Минздрава России. - 3. № 2005103199/15; заявл. 08.02.2005; опубл. 27.01.2006]. Даний спосіб прогнозування спайкової хвороби очеревини є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. В основу винаходу поставлена задача розширення арсеналу ефективних способів прогнозування спайкової хвороби очеревини. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі прогнозування спайкової хвороби очеревини шляхом виділення з проби крові ДНК і проведення генотипування поліморфізму гена методом ПЛР, згідно з винаходом, виявляють поліморфізм гена ITGA 2 шляхом виділення методом ПЛР за допомогою набору реагентів для ампліфікації "SNP-ЕКСПРЕС-РВ" з лейкоцитів цільної крові геномної ДНК, аналіз якої проводять за допомогою реагенту "ДНК-експрес-кров", і за наявності гетерозиготи СТ або гомозиготи СС прогнозують розвиток спайкової хвороби очеревини. Технічний ефект винаходу, а саме розширення арсеналу ефективних способів прогнозування спайкової хвороби очеревини, обумовлений синергізмом заходів технології, що заявляється. Спосіб виконують наступним чином: Виявляють поліморфізм гена ITGA 2 шляхом виділення методом ПЛР за допомогою набору реагентів для ампліфікації "SNP-ЕКСПРЕС-РВ" з лейкоцитів цільної крові геномної ДНК, аналіз якої проводять за допомогою реагенту "ДНК-експрес-кров", і за наявності гетерозиготи СТ або гомозиготи СС прогнозують розвиток спайкової хвороби очеревини. Теоретичною передумовою технології, яка заявляється, послужив той факт, що альфа-2 інтегрин ITGA 2 бере активну участь у регуляції експресії генів колагену і колагенази, що в свою чергу впливає на процеси утворення позаклітинного матриксу. Цей інтегрин має трансмембранний фрагмент, що забезпечує адгезію, і внутрішньоклітинний фрагмент, який 1 UA 110915 C2 5 10 15 20 25 30 35 бере участь в регуляції генів колагену. Ген ITGA 2 локалізований у 5 хромосомі, мутації цього гена можуть бути у вигляді заміни нуклеотиду цитозину (С) на тимін (Т) у позиції 807 ділянки послідовності ДНК гена ITGA 2, ця мутація призводить до заміни амінокислоти в пептидному ланцюзі молекули альфа-2 - субодиниці інтегринів. Даний поліморфізм позначається як генетичний маркер С807Т. Популяційна частота алеля Т, яка зустрічається, в Європейській популяції, становить близько 40 %. Ефективність способу доведена клінічними дослідженнями. 50 пацієнтів з хірургічної абдомінальної патологією досліджуваної популяційної вибірки, залежно від виявленого синдромокомплексу класифікували на 3 групи: 1-а група - 18 осіб (36 % від усієї популяційної вибірки), що мають одиничні симптоми СХО; 2-а група - 14 осіб (28 %) хворі, які мають не більше двох симптомів СХО; 3-я група 11 осіб (22 %) - хворі з трьома і більше симптомами СХО, 7 хворих (14 %) - вперше оперовані на органах черевної порожнини. Виявлення мутацій гена ITGA-2 в геномі пацієнтів визначали методом ПЛР за допомогою набору реагентів для ампліфікації "SNP-ЕКСПРЕС-РВ". Проводили аналіз геномної ДНК, виділеної з лейкоцитів цільної крові пацієнтів, за допомогою спеціального реагенту "ДНКекспрес-кров". Зразки крові центрифугували при 3000 об/хв, отримували осад формених елементів, який витримували при -20 °C до повного заморожування. Після розморожування зразків у пробірки вносили реагент "ДНК-експрес-кров". Потім прогрівали при 99 °C протягом 15 хв. Зразки центрифугували при 8000 об/хв… протягом 1 хвилини, отриманий супернатант використовували як досліджуваний зразок ДНК. При виконанні ПЛР для отримання реагентів ампліфікації готували реакційні суміші алеля 1 і алеля 2. Зразок виділеної ДНК ампліфікували з двома парами алель-специфічних праймерів. Досліджувані зразки вносили у пробірки з робочою ампліфікаційною сумішшю: алель 1 і алель 2 відповідно. В якості негативного контрольного зразка використовували розчинник, в якості позитивного контролю - позитивний контроль ДНК. Детекцію продуктів ПЛР проводили, використовуючи програмований ампліфікатор, поєднаний з оптичною системою детекції флуоресцентного сигналу. Використовували інтеркалючий барвник Green, який флуоресціює при вбудовуванні в дволанцюговий продукт ДНК, що утворюється. При цьому використовували FRET-зонди. Система дозволяє проводити ПЛР і реєструвати сигнал від зразків за заданими каналами. За кривими накопичення флуоресцентного сигналу виконували аналіз результатів. Для проведення ампліфікації використовували позитивний і негативний контрольні зразки ДНК. У 50 пацієнтів з абдомінальної патологією досліджували частоту можливих точкових мутацій заміни пар основ цитозину (С) на тимін (Т) в послідовності гена ITGA 2. Розподіл пацієнтів з абдомінальної патологією з наявністю гапло- і диплотипів заміни пар основ цитозину (С) на тимін (Т) представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Частота мутації гена ITGA 2, яка зустрічається у хворих з абдомінальної патологією Пацієнти з абдомінальною патологією Абсолютна кількість пацієнтів (n=50) Частота, з якою зустрічається, % 40 45 Гомозигота СС 17 34 % Гетерозигота СТ 29 58 % Гомозигота ТТ 4 8% Нормальний диплотип СС гена ITGA 2 виявили у 17 пацієнтів з абдомінальної патологією, що склало 34 %. Мутантний диплотип і гаплотип виділили у 33 обстежуваних хворих з хірургічною абдомінальної патологією, що склало 66 %. Максимальна частота (58 %), з якою зустрічаються гаплотипи СТ, була виявлена у 29 пацієнтів. Диплотип ТТ зустрічався рідше серед обстежених пацієнтів (4), що склало 8 %. Таким чином, у 29 обстежених пацієнтів виявили поодинокі заміни основ цитозину на тимін (СТ), що склало 58 %. Заміна обох основ на тимін - (ТТ) була виявлена тільки у 4 пацієнтів (табл. 1). Отже, найбільша частота - 58 % серед обстежених пацієнтів, припадала на мутантний гаплотип СТ, а мутантні диплотипи ТТ зустрічалися тільки у 8 % випадків обстежень. У 43 обстежених пацієнтів з 50 виявлено ознаки СХО. Генетичний поліморфізм гена ITGA 2 вивчали у 43 хворих, які були оперовані за показаннями на органах черевної порожнини. 50 2 UA 110915 C2 Таблиця 2 Частота мутації гена ITGA 2, яка зустрічається у хворих з абдомінальної патологією, оперованих на органах черевної порожнини Пацієнти з абдомінальною патологією Абсолютна кількість пацієнтів (n=43) Частота, з якою зустрічається, % 5 10 15 20 Гомозигота СС 15 34,8 % Гетерозигота СТ 24 55,8 % Гомозигота ТТ 4 9,4 % Аналіз частоти наявних точкових мутацій виявили у 28 пацієнтів з СХО, що склало 64,2 % від усієї вибірки. У 15 пацієнтів, що склало 34,8 % вибірки, не виявили точкові мутації заміни С на Τ в гені ITGA 2. Мутації гена ITGA 2 виявлені в гетерозиготному стані (СТ) у 24 хворих, що склало 55,8 %. Мутації в гомозиготному стані при заміні основ СС на ТТ були ідентифіковані тільки у 4 хворих, що склало 9,4 %. Найбільш тяжкі прояви СХО були виявлені у пацієнтів з подвійною заміною основ ТТ. Таким чином, при наявності 2 мутантних алелів гена ITGA 2 у пацієнтів з спайковою хворобою очеревини, кількість симптомів, що характеризують тяжкий перебіг СХО, була максимальною. Аналіз результатів обстеження генетичних факторів у хворих з різним ступенем тяжкості і поширеності спайкової хвороби свідчить про наявність взаємозв'язку вираженого поліморфізму гена ITGA 2, ступеня вираженості імунопатологічних реакцій і тяжкості прояву синдромокомплексу спайкової хвороби. У групі С-С з нормальними алелями гена, очевидно, ключова роль у патогенезі належить іншим факторам метаболізму. У групі С-Т, можливо, мають місце полігенні порушення. Таким чином, аналіз результатів генетичних обстежень у хворих з різним ступенем тяжкості спайкової хвороби свідчить про наявність взаємозв'язку вираженого поліморфізму гена ITGA 2, ступеня вираженості імунопатологічних реакцій і тяжкості прояву синдромокомплексу спайкової хвороби. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 Спосіб прогнозування спайкової хвороби очеревини шляхом виділення з проби крові дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) і проведення генотипування поліморфізму гена методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який відрізняється тим, що виявляють поліморфізм гена ITGA 2 шляхом виділення з лейкоцитів цільної крові геномної ДНК методом ПЛР за допомогою набору реагентів для ампліфікації "SNP-ЕКСПРЕС-РВ", аналіз проводять за допомогою реагенту "ДНК-експрес-кров", і за наявності гетерозиготи СТ або гомозиготи СС прогнозують розвиток спайкової хвороби очеревини. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3