Спосіб лікування нейродегенеративних захворювань у щурів

Реферат: Спосіб лікування нейродегенеративних захворювань у щурів здійснюють шляхом введення мезенхімальних стовбурових клітин. Крім цього, здійснюють інтракраніальну трансплантацію клітин на 1, 3, 7, 14 добу, для чого готують біодеградований нейротрансплантат заданого об'єму на основі суміші аутологічної плазми крові та суспензії індукованих в нейрональному напрямку стовбурових клітин шляхом формування фібринового гелю за допомогою СаСl2. UA 111067 U (12) UA 111067 U UA 111067 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології та медицини, зокрема - до неврології та відновної нейрохірургії і може бути використаний при лікуванні ішемічного інсульту та інших нейродегенеративних захворювань. Відомим є спосіб лікування спинального інсульту, який полягає у субарахноїдальній трансплантації фетальних нервових тканин людини шляхом люмбальної пункції (Брюховецкий А.С. Клинико-патогенетическое обоснование применения фетальных тканей человека при заболеваниях центральной нервной системы /А.С. Брюховецкий, С.О. Ушаков //Трансплантация фетальных тканей человека. - Москва, 1996. - С. 53-56.). Недоліками цього способу є рамки терапевтичного/лікувального призначення субарахноідальної трансплантації, етико-правові проблеми застосування ембріонів людини, питання біологічної, індивідуальної, імунологічної несумісності, що призводить до відторгнення організмом реципієнта чужорідних клітин. Незважаючи на ретельний мікробіологічний контроль біологічного. матеріалу, зберігається небезпека зараження інфекційними захворюваннями (Щегельская Е.А., Микулинский Ю.Е. Стромальные клетки костного мозга и перспективы их использования в регенеративной медицине /Е.А. Щегельская, Ю.Е. Микулинский //Трансплантология. - 2004. - Том 7(3). - С. 108113). Найбільш близьким та вибраним за прототип є спосіб лікування гострої фокальної ішемії щура, який здійснюють шляхом доставки в організм мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) у систему кровообігу тварини через хвостову вену (Патент № 2143867 Російська Федерація). У разі застосування цього способу лікування переважає генералізований характер розповсюдження МСК з незначною адсорбцією у locus morbid. Також існує проблема міграції МСК і продуктів їх секреції через гематоенцефалічний бар'єр. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу лікування нейродегенеративних захворювань у щурів, в якому за рахунок зміни носія трансплантованих клітин, досягається трансплантації МСК в субстраті, за рахунок чого вони можуть бути інтегровані в тканини мозку в зоні пошкодження. Поставлена задача вирішується в способі лікування нейродегенеративних захворювань у щурів, який здійснюють шляхом введення мезенхімальних стовбурових клітин, згідно з корисною моделлю, здійснюють інтракраніальну трансплантацію клітин на 1, 3, 7, 14 добу, для чого готують біодеградований нейротрансплантат заданого об'єму на основі суміші аутологічної плазми крові та суспензії індукованих в нейрональному напрямку стовбурових клітин шляхом формування фібринового гелю за допомогою СаСl2. Застосування біодеградуючого субстрату сприяє стійкій фіксації МСК, як на матричній речовині застосованого біологічного носія, так і на тканинних елементах головного мозку, його оболонках. Біодеградуючий субстрат не викликає реакцію імунологічного відторгнення, розвитку некрозу, появи кальцинатів тощо. Використання заявленого матеріалу сприяє посиленню відновних процесів у locus morbi, зменшенню запалення та репарації нервової та судинних тканин, не викликає появи побічних ефектів, розвитку атипового розподілу клітин. Піддослідна тварина є власним донором стовбурових клітин, необхідних для клітинної терапії. Застосування мезенхімальних клітин кісткового мозку (МСК КМ), як джерела мультипотентних стовбурових клітин сприяє перетинанню бар'єра імунологічної несумісності тканин та вирішує етично-правові проблеми, пов'язані з застосуванням ембріонального об'єкта. За рахунок міграції та абсорбції трансплантовані клітини утворюють потужну мережу контактів з нейронами мозку, виділяють нейромедіатори, синтезують нейроно- та астроцитоспецифічні білки, трофічні фактори, що приводить до зниження ступеня виразності апоптозу, покращення функціонального стану організму в цілому. Аутотрансплантат облишений токсичної дії, індукції пухлинного росту, аутоімунних реакцій. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. МСК отримують шляхом аспірації зі стегнової та великої гомілкової кісток за стандартними протоколами. Суспензію кісткового мозку ресуспендують і двічі відмивають у розчині Хенкса, центрифугуючи протягом 10 хвилин при 400 g. Відмиті клітини ресуспензують у культуральному середовищі DMEM/F12(1:1) (Sigma) з 10 % фетальною бичачою сироваткою (ФБС) (Sigma) та 2 розсіюють по 100 млн. клітин на культуральну судину (80 см , Nunc). Через 24 год. Культивування середовище з неприкріпленими до субстрату клітинами кісткового мозку видаляють, тричі промивають клітини розчином Хенкса, додають свіже середовище і продовжують культивувати прикріплені фібробластоподібні клітини ще два тижні для отримання первинної культури КСКМ. До прикріплених до дна судин клітин додають свіже культуральне середовище й культивують клітини строми при 37 °C та 5 % СаСl2 у повітрі. Через 5 діб змінюють середовище і потім продовжують культивувати клітини ще 8-10 діб до утворення 1 UA 111067 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 клітинного моношару, змінюючи середовище кожні 3 доби. Морфологію клітин оцінюють у живій культурі, а їх життєздатність після фарбування з трипановим блакитним (0,1 %). Для диференціювання МСК клітин у нейробласти використовують розчин ретиноєвої -6 кислоти на розчині Хенкса (10 М). Індуковані клітини використовують через 1,5-2 години після додавання до них індукційного середовища. Всі етапи приготування носія проводять у ламінарному боксі. Для отримання плазми крові в стерильну центрифугальну пробірку з антикоагулянтом (1 мл 3,8 % цитрату натрію) набирають 10 мл венозної крові пацієнта і центрифугують її при 450 g протягом 15 хвилин. Відбирають плазму, яку використовують для приготування носія. Частину плазми змішують з суспензією нейроіндукованих МСК на фізіологічному розчині (1:1), додають 10 % розчин СаСl2 до кінцевої концентрації в розчині 0,3 % й енергійно ресуспендують протягом 2 секунд. Після цього ємність з субстратом ставлять для полімеризації в СО 2 - інкубатор (5 % СО2, 37 °С) на 30 хвилин. В результаті отримують біодеградований субстрат необхідної форми та об'єму, що складається з матриксу фібрилярного фібрину та МСК КМ, що рівномірно розповсюджені по всій товщі субстрату. Приклад. Спосіб апробований при лікуванні щурів з модельованим ішемічним інсультом. Експерименти проводили на самцях щурів лінії Вістар 3-місячного віку. Ішемічний інсульт у щурів моделювали шляхом емболізації (за допомогою суспензії сульфату барію (II)) гілок внутрішньої сонної артерії у правій півкулі головного мозку в умовах функціонуючого кровотоку. Таким чином досягали виключення магістрального та колатерального кровотоку у правій півкулі головного мозку тварин, що спричиняло виникнення його гострого ішемічного ушкодження. Хірургічне втручання виконували поетапно, під інтраперитонеальним кетаміновим наркозом (з розрахунку 125 мг на 1 кг маси тіла тварини). Голову щура фіксували за допомогою смужки лейкопластиру. Попередньо епільовану поверхню передньолатеральної ділянки шиї тварини обробляли 5 % спиртовим розчином йоду, розрізали шкіру від яремної вирізки рукоятки грудини до нижньої щелепи. Виділяли стовбур загальної сонної артерії, під який підводили дві лігатури з метою її іммобілізації. Судину пунктували і внутрішньоартеріально вводили 0,1-0,2 мл суспензії сульфату барію (II). Дистальну та проксимальну лігатури зав'язували з метою забезпечення остаточного гемостазу. Операційну рану пошарово зашивали. Для приготування субстрату використовують плазму реципієнта клітин. Необхідний об'єм 6 плазми наливають у сосуд необхідної для операції форми, додають 0,4×10 нейроіндукованих МСК кісткового мозку й ретельно ресуспендують. Одразу після цього до суміші додають 10 % розчин СаСl2. За 30 хвилин інкубування в СО2-інкубаторі отримують біодеградуючий субстрат об'ємом 50 мкл, що складається з матриксу фібрину та нейроіндукованих МСК КМ. Нейротрансплантати вводять реципієнтам інтракраніально на 1, 3, 7, 14 добу після операції. Щура под каліпсоловим наркозом фіксують на столику для препарування у положенні на животі. За цим відповідно лінії, що з'єднувала зовнішні слухові отвори піддослідних щурів, виконують розтин. Шкіру голови, м'язи та сухожилки обережно скальпують. Праворуч від сагітального шва фронтопарієтальної зони черепа щура портативною бормашинкою створюють трепанаційний отвір розміром 3×3 мм. Обережно видаляють останки кістки та тверду мозкову оболонку. На оголену сіру речовину lobulus paracentralis (тім'яна частка) правої півкулі головного мозку щура наносять біодеградуючий субстрат (фібринова плівка) із МСК. Післяопераційну рану зашивають пошарово, фіксують стерільною пов'язкою, закріпленою лейкопластирною смугою. Спосіб є менш травматичним у технічному виконанні (у порівнянні зі стереотаксичним, та внутрішньошлунковим введенням) за рахунок відсутності травми мозкової речовини під час пункції шлуночку мозку або стереотаксичного введення в область підкоркових гангліїв. Ефективність трансплантації оцінюють за провідними морфологічними та функціональними критеріями: організація деструктивно-дегенеративних вогнищ, формування гліомезодермального рубця, розвиток нейро-, синапсогенезу, відновлення когнітивних функцій. Таким чином, інтракраніальна трансплантація з використанням біодеградуючого субстрату як носія стовбурових клітин є технічно доступним, простим, малотравматичним та ефективним способом лікування ішемічного інсульту головного мозку в експерименті. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб лікування нейродегенеративних захворювань у щурів, який здійснюють шляхом введення мезенхімальних стовбурових клітин, який відрізняється тим, що здійснюють інтракраніальну трансплантацію клітин на 1, 3, 7, 14 добу, для чого готують біодеградований нейротрансплантат заданого об'єму на основі суміші аутологічної плазми крові та суспензії 2 UA 111067 U індукованих в нейрональному напрямку стовбурових клітин шляхом формування фібринового гелю за допомогою СаСl2. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3