Спосіб оцінки функціонального стану гепатоцитів

Реферат: Спосіб оцінки функціонального стану гепатоцитів шляхом фарбування гістологічних препаратів ядерними барвниками. Проводять оцифровку фарбованих мікроскопічних гістологічних зрізів з x використанням об'єктива мікроскопа 60 , потім цифрове зображення ядер одноядерних гепатоцитів (диплоїдні ядра) аналізують методом комп'ютерної мікроденситометрії та обраховують коефіцієнт варіації оптичної густини забарвлення ядра. Далі оцінюють функціональний стан гепатоцитів. UA 112495 U (12) UA 112495 U UA 112495 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до патологічної анатомії, гепатології, терапії та гістології, та може бути використана для морфологічної діагностики функціонального стану гепатоцитів. Печінка виконує більшість життєво важливих метаболічних функцій в організмі та є основним органом, який забезпечує метаболізм (детоксикацію) екзо- та ендогенних токсинів, лікарських засобів та ксенобіотиків. У реалізації більшості цих функцій бере участь ДНК ядра гепатоцитів шляхом залучення останньої до процесів продукції різних протеїнів (через посередництво відповідних РНК) ферментів, структурних та рецепторних білків тощо. Вважається, що функціональне навантаження ядра із залученням ДНК віддзеркалює будова ядерного хроматину. Зокрема, про підсилення активності ДНК ядра у вказаних процесах свідчить зсув балансу еухроматин/гетерохроматин у бік першого. Все це принципово важливо враховувати при оцінці морфофункціональних особливостей гепатоцитів. Відомо, що гепатоцити є структурно та функціонально гетерогенними: темні гепатоцити периферії печінкових дольок забезпечують синететичну функцію печінки, світлі гепатоцити центрів дольок - детоксикаційну функцію. Морфологічний аналіз особливостей функціонування клітин печінки, які забезпечують її спеціалізовану функцію, дозволяє найбільш повно розкрити морфогенез захворювань печінки. Аналогом корисної моделі є спосіб оцінки організації ядерного хроматину клітин людини та тварин (Пат. 13218 Україна, МПК G01N 33/00, G01N 15/00. Спосіб оцінки організації ядерного хроматину клітин людини та тварин / Яковець К.І., Давиденко І.С., Давиденко О.М.; Заявник Буковинський державний медичний університет. - № заяви и200509511 від 10.10.2005; опубл. 15.03.2006, Бюл. №3), в якому після забарвлення ядерним барвником гістологічного чи цитологічного препарату органа чи тканини людини або тварини, організацію ядерного хроматину об'єктивно оцінюють за показником "відхилення яскравості", величину якого отримують на підставі комп'ютерного аналізу цифрової копії зображення забарвленого клітинного ядра. Недоліком аналога-способу є те, що він є коректним тільки для визначення розподілу ядерного хроматину в клітинах одного типу, проте недостатньо точно оцінює ступінь організації цієї субстанції в клітинах різних типів. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб діагностики гістопатологічних змін шляхом фарбування гістологічних препаратів ядерними барвниками та оцінки характеру розподілу хроматину (Общая патология человека: руководство для врачей: в 2 т. / [под. ред. А.И. Струкова, В.В. Серова, Д.С. Саркисова]. - [2-е изд.]. - М.: Медицина, 1990. - Т.1 - С. 44-45), в якому фарбують ядерними барвниками хроматин у гістологічних або цитологічних препаратах та проводять суб'єктивну оцінку характеру розподілу хроматину у ядрах клітин, з врахуванням дифузного або гетерогенного характеру забарвлення ядер. Недоліком найближчого аналога є суб'єктивність основної оцінки, яка може спричинити порушення відтворюваності результатів наукових та клінічних досліджень. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити спосіб оцінки функціонального стану гепатоцитів шляхом проведення оцінки організації ядерного хроматину та відповідно функціонального стану гепатоцитів засобами комп'ютерної мікроденситометрії цифрових фотографій із визначенням коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення ядра. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб оцінки функціонального стану гепатоцитів шляхом фарбування гістологічних препаратів ядерними барвниками, згідно з корисною моделлю, проводять оцифровку фарбованих мікроскопічних гістологічних зрізів з x використанням об'єктива мікроскопа 60 , потім цифрове зображення ядер одноядерпих гепатоцитів (диплоїдні ядра) аналізують методом комп'ютерної мікроденситометрії та обраховують коефіцієнт варіації оптичної густини забарвлення ядра, далі оцінюють функціональний стан гепатоцитів: збільшення коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення ядра відповідає гетерогенному забарвленню і гетерохроматичній організації хроматину, і є морфологічним субстратом щодо трактування обмеження функціональної здатності гепатоцитів; а його зниження вказує на збільшення гомогенності забарвлення ядра гепатоцитів, що свідчить про збільшення їх активності щодо залучення ДНК до синтетичних процесів. Спільними ознаками найближчого аналога та корисної моделі є фарбування гістологічних препаратів ядерними барвниками. Відмінними ознаками найближчого аналога та корисної моделі є те, що оцінку ступеня організації ядерного хроматину та відповідно функціонального стану гепатоцитів проводять засобами комп'ютерної мікроденситометрії з обрахуванням коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення ядра; його збільшення відповідає гетерогенному забарвленню і 1 UA 112495 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 гетерохроматичній організації хроматину, і є морфологічним субстратом щодо трактування обмеження функціональної здатності гепатоцитів; а його зниження вказує на збільшення гомогенності забарвлення ядра гепатоцитів, що свідчить про збільшення їх активності щодо залучення ДНК до синтетичних процесів. Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: гепатоцит, функціональний стан, коефіцієнт варіації оптичної густини забарвлення ядра. Функціональний стан ядра знаходить відображення в характері та типі розподілу хроматину. Так, в зовнішніх відділах диплоїдних ядер нормальних тканин знаходять конденсований (компактний) хроматин - гетерохроматин, а в решті її відділів - неконденсований хроматин еухроматин. Еухроматин при забарвленні гематоксиліном Гарісса (ядерним барвником), виглядає як ділянки дифузного профарбовування в клітинному ядрі, а гетерохроматин - як ділянки гранулярного більш темного забарвлення. Гетерохроматин та еухроматин відображують різні функціональні стани ядра; перший з них вважають неактивним, другий досить активним та таким, що відображує участь ядра у різних метаболічних непроліферативних та проліферативних процесах. Оскільки ядро може переходити зі стану відносного функціонального покою в стан функціональної активності і навпаки, морфологічна картина розподілу хроматину, представлена гетеро- та еухроматином, не може бути статичною. Можлива гетерохроматинізація та еухроматинізація ядер. Спосіб здійснюється наступним чином. Шматочки тканини печінки фіксують у 5 % водному розчині сульфосаліцилової кислоти впродовж 24 годин. Зневоднюють зразок тканини у висхідній батареї спиртів. Проводять його заливку у парафін при температурі 56 °C (для збереження параметрів ядра). На санному мікротомі виготовляють гістологічний зріз товщиною 5 мкм. Фарбують гематоксиліном Гарріса гістологічний зріз тканини печінки, після чого отримують цифрову копію мікроскопічного х зображення з використанням об'єктива мікроскопа 60 , з метою забезпечення деталізації ядерного хроматину. Потім цифрове зображення ядер одноядерних гепатоцитів (диплоїдні ядра) аналізують методом комп'ютерної мікроденситометрії та вимірюють середню арифметичну оптичної густини забарвлення ядра (у відносних одиницях оптичної густини у діапазоні від 0 - відсутність забарвлення, абсолютна прозорість, до 1 - максимальне забарвлення, абсолютна непрозорість) та показник середньоквадратичного відхилення оптичної густини забарвлення ядра (у відносних одиницях оптичної густини). Обраховування коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення (вираженого у відсотках) здійснюють шляхом ділення величини середньоквадратичного відхилення оптичної густини забарвлення ядра на середню арифметичну оптичної густини забарвлення ядра із множенням на 100. За величиною цього показника судять про ступінь організації ядерного хроматину. Так, збільшення величини коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення ядра відповідає гетерогенному забарвленню і гетерохроматичній організації хроматину, і, отже, є морфологічним субстратом щодо трактування обмеження функціональної здатності гепатоцитів. Відповідно зниження коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення вказує на збільшення гомогенності забарвлення ядра гепатоцитів, що свідчить про збільшення їх активності щодо залучення ДНК до синтетичних процесів. Технічний результат. Запропонований спосіб дозволяє ефективно визначати ступінь організації ядерного хроматину, а отже і судити про функціональний стан гепатоцитів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб оцінки функціонального стану гепатоцитів шляхом фарбування гістологічних препаратів ядерними барвниками, який відрізняється тим, що проводять оцифровку фарбованих x мікроскопічних гістологічних зрізів з використанням об'єктива мікроскопа 60 , потім цифрове зображення ядер одноядерних гепатоцитів (диплоїдні ядра) аналізують методом комп'ютерної мікроденситометрії та обраховують коефіцієнт варіації оптичної густини забарвлення ядра, далі оцінюють функціональний стан гепатоцитів: збільшення коефіцієнта варіації оптичної густини забарвлення ядра відповідає гетерогенному забарвленню і гетерохроматичній організації хроматину, і є морфологічним субстратом щодо трактування обмеження функціональної здатності гепатоцитів; а його зниження вказує на збільшення гомогенності забарвлення ядра гепатоцитів, що свідчить про збільшення їх активності щодо залучення ДНК до синтетичних процесів. 2 UA 112495 U Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3