Спосіб обробки рослинного матеріалу для отримання гаплоїдів ячменю ярого у культурі пиляків in vitro

Реферат: UA 113261 C2 (12) UA 113261 C2 Запропонований винахід належить до галузі сільського господарства, зокрема селекції рослин з використанням методів біотехнології. Об'єктом запропонованого винаходу є спосіб обробки рослинного матеріалу для отримання гаплоїдів ячменю ярого у культурі пиляків in vitro. Спосіб включає довготривале зберігання колосся в умовах низької плюсової температури, вилучення пиляків і отримання гаплоїдних рослин. На зберігання закладають колосся, отримане з пагонів, попередньо витриманих у воді впродовж п'яти діб при температурі 4 °C, після чого вилучене з листової піхви колосся піддають стерилізації, видаляють ості і вміщують у стерильні ємкості з високим рівнем відносної вологості та зберігають впродовж 22-28 діб при температурі 4 °C. Спосіб дозволяє підвищити ефективність отримання гаплоїдів ячменю ярого у культурі пиляків in vitro та збільшити обсяг робіт з гаплоїдизації за рахунок подовження тривалості періоду інокуляції пиляків на штучне живильне середовище. UA 113261 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Винахід належить до галузі сільського господарства і біотехнології, а саме - до способів попередньої обробки колосся, які використовуються для отримання гаплоїдів ячменю ярого в культурі пиляків in vitro. Суть розробки полягає у тому, що на довготривале (до 28 діб) зберігання в умовах низької позитивної температури (4 °C) закладається колосся, витримане впродовж п'яти діб у пагонах у воді при температурі 4 °C, замість колосся, вилученого із свіжого матеріалу. Це дозволяє істотно збільшити частоти індукції калюсу, ембріоїдів і регенерації рослин у культурі пиляків in vitro за рахунок кращої збереженості рослинного матеріалу, а також збільшити обсяги робіт з гаплоїдизації завдяки подовженню періоду експлантації пиляків на живильне середовище. Відомий спосіб отримання гаплоїдів ячменю ярого у культурі пиляків in vitro за використання для вилучення пиляків свіжого рослинного матеріалу (аналог 1) [1, 2, 3]. Однак через придатність для інокуляції на живильне середовище лише пиляків з мікроспорами у вакуолізованій фазі, яка зберігається при температурі 25 °C впродовж 48 годин [4], тривалість періоду добру матеріалу і його експлантації на середовище є невеликою, близько трьох - п'яти діб для кожного генотипу. Усунути цей недолік та істотно подовжити часовий інтервал закладання дослідів із отримання гаплоїдів у культурі пиляків in vitro за рахунок затримки переходу мікроспор до гаметогенезу і синхронізації їх розвитку дозволяє зберігання рослинного матеріалу в умовах низької позитивної температура (4 °C) у вигляді пагонів, кінці яких вміщено у воду (аналог 2) [5]. Але за цього способу затримка фази розвитку мікроспор може сягати від 3 до 10 діб в залежності від генотипу, умов вирощування рослин-донорів пиляків та їх якості як вихідного матеріалу для вилучення пиляків. До того ж необхідним є цитологічний контроль фази розвитку мікроспор перед вилученням пиляків та їх висаджуванням на живильне середовище. Відомий спосіб довготривалого зберігання матеріалу від 14 до 28 діб при температурі відповідно 8 °C і 4 °C у вигляді ізольованого колосся, вміщеного у чашки Петрі в умовах високої відносної вологості, але без прямого контакту колосся з водою (прототип) [6, 7]. Проте для цього способу проблемою є втрата колоссям тургору аж до повного висихання, що робить його непридатним для вилучення пиляків [5]. Задачею запропонованого винаходу є одночасне усунення цих недоліків і розробка способу попередньої обробки ізольованого колосся в умовах низької позитивної температури, який забезпечує його довготривале зберігання без втрати якості та з життєздатними мікроспорами у вакуолізованій фазі розвитку і сприяє підвищенню ефективності отримання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro. Поставлена задача вирішується шляхом використання для довготривалого (до 28 діб при температурі 4 °C), зберігання колосся яке попередньо було піддано низькотемпературній обробці за аналогічного температурного режиму у вигляді пагонів у воді впродовж п'яти діб. Суть винаходу полягає в тому, що на відміну від прототипу для довготривалого зберігання використовується не свіже колосся, а попередньо оброблене в умовах низької плюсової температури. Саме витримування зрізаних пагонів у воді навіть за несприятливих умов вирощування рослин-донорів пиляків, зокрема посухи і відсутності опадів, дозволяє вилученому з них колоссю зберігати тургор за подальшого довготривалого зберігання. Важливою перевагою запропонованого винаходу є збереження мікроспорами необхідної фази для індукування спорофітного розвитку впродовж тривалого часу і отримання високих показників частот морфогенних пиляків і регенерації рослин, які наведено в таблиці. 45 Таблиця Результативність культури in vitro пиляків лінії ярого ячменю ДГ00-126 залежно від режиму і способу попередньої обробки колосся Режим і спосіб попередньої обробки Без обробки (свіжий матеріал) (аналог 1) Пагони, вода, 4 °C, 5 діб (аналог 2) Отримано Висаджено зелених рослинморфогенних пиляків пиляків, шт. регенерантів шт. % шт. % 376 134 35,64 130 34,57 460 136 29,56 79 17,17 1 UA 113261 C2 Продовження таблиці Колосся, без води, 4 °C, 28 діб (прототип) Пагони, вода, 4 °C, 5 діб, колосся, без води, 4 °C, 23 доби (пропоноване технічне рішення) НІР05 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 351 0 0 0 0 223 137 61,43 82 36,77 6,08 5,68 Як свідчать результати досліджень (див. таблиця), довготривале зберігання свіжого матеріалу призвело до цілковитої втрати пиляками здатності до андрогенезу in vitro (прототип). Натомість матеріал, який було піддано комбінованій обробці згідно пропонованого способу, за здатністю до продукування морфогенних структур у пиляках, культивованих in vitro істотно перевищив усі інші способи. За кількістю отриманих рослин-регенерантів запропоноване технічне рішення було на рівні способу отримання гаплоїдів у культурі пиляків in vitro із свіжого матеріалу (аналог 1), істотно перевищивши спосіб, який ґрунтується на зберіганні зрізаних пагонів у воді (аналог 2). Окрім того, спосіб зберігання колосся в чашках Петрі був більш технологічним порівняно з зберіганням пагонів у воді, так як сприяв більш ефективному використанню об'єму холодильної камери (рис.) і забезпечував енергозбереження. Для кращого розуміння суті винаходу наводяться приклади. Приклад 1 Попередня обробка колосся. Зрізані у полі чи теплиці пагони вміщують у воду і витримують у холодильнику при температурі 4 °C впродовж 5 діб у темряві. Після закінчення цього терміну добирають типові пагони за результатами вибіркового цитологічного аналізу фази розвитку мікроспор на тимчасових препаратах пиляків видалених з середньої частини колосу, забарвлених 2 %-им розчином карміну у 45 %-ій оцтовій кислоті. Відокремлюють верхню та нижню частини пагонів і отримане колосся без вилучення з листової піхви піддають стерилізації 70° етиловим спиртом у ламінарному боксі впродовж 15-20 хв., вміщуючи по 5-7 шт. між двома шарами вати, зволоженої спиртом. За допомогою знезаражених шляхом прожарювання у полум'ї спиртівки скальпеля і пінцета вилучають колосся, видаляють ості і вміщують його у стерильні чашки Петрі діаметром 9 см по 10-15 шт. В разі необхідності може бути проведений додатковий цитологічний контроль. Для цього пиляки з колоса вилучають стерильним пінцетом. Для підтримання високого рівня відносної вологості у велику чашку Петрі ставлять стерильну пластикову чашку одноразового використання діаметром 35-40 мм (без кришки), яку заповнюють стерильною дистильованою водою. Чашки з колоссям заклеюють лабораторною плівкою Parafilm, і зберігають у холодильнику впродовж 22-28 діб при температурі 4 °C у темряві. Приклад 2 Отримання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro. Для отримання асептичної культури пиляків використовують попередньо оброблене згідно з запропонованим способом колосся без повторної стерилізації. В асептичних умовах ламінарного боксу з колосся вилучать пиляки і висаджують у чашки Петрі або пробірки на поверхню живильного середовища (пиляки з одного колоса - в одну чашку чи пробірку). До складу живильного середовища NМSмод.2 [5], для культивування пиляків in vitro та індукції андрогенних структур входять макроелементи середовища N6 [8], мікроелементи середовища MS [9] і такі компоненти в мг/л: 2,4-Д 2 (2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота); БАП (6бензиламінопурин) - 0,5; В1-1; В6 і РР - по 0,5; гліцин - 2; аланін і пролін - по 100; глутамін - 200; лактальбумін - 300; міо-інозитол - 100; а також мальтозу - 90 г/л; картопляний екстракт - 20 % від об'єму.; агар-агар - 8 г/л. Середовище піддають стерилізації в автоклаві при температурі 120±2 °C і тиску 78 кПа протягом 20 хвилин. Чашки Петрі і пробірки з висадженими на індукційне живильне середовище пиляками вміщують у термостат та інкубують при температурі 24 °C впродовж 30-35 діб. Отримані андрогенні структури - калюс та ембріоїди - пересаджують на регенераційне живильне середовище Р: мінеральна основа MS, вітаміни В1; В6 і РР - по 0,5 мг/л; глутамін, міоінозитол по - 100 мг/л; сахароза - 30 г/л; агар-агар - 0,8 %. Регенерацію проводять при освітленні 4-5 клк, фотоперіоді 16 годин і температурі 22-24 °C. Рослини, отримані на 2 UA 113261 C2 5 10 15 20 індукційному середовищі шляхом проростання ембріоїдів, культивують на мінімальному середовищі MS. Джерела інформації: 1. Clapham P. Haploid Hordeum plants fromanthers in vitro / P. Claham // Z. Pflanzenzücht. 1973, - v. 69. - P. 142-155. 2. Kasha K. J. Production of haploids in cereals / R. J. Kasha // Current options for cereal improvement. - Ontario: Klumer Academic Publisher, 1989. - P. 71-80. 3. Kao K.N., Saleem M., Abrams S., Pedras M., Mallard С. Culture conditions for induction of green plants from barley microspores by anther culture methods / K. N. Kao, M. Saleem., S. Abrams, M. Pedras., С. Mallard // Plant Cell Reports. - 1991. - 9, N 11. - P. 595-601. 4. Sunderland N., Huang B. Barley anther culture: the switch of programme and albinism / N. Sunderland, B. Huang // Hereditas. - 1985. - Supl. 3. - P. 27-40. 5. Білинська О.В. Генотипові особливості індукції гаплоїдів ячменю (H. vulgare L.) методом культури пиляків in vitro: автореф. дис. на здобуття наук, ступеня канд. біол. наук: спец. 03.00.15 "Генетика" / О.В. Білинська. - Харків, 1997. - 19 с. 6. Huang В., Sunderland N. Temperature-stress pretreatment in barley anther culture / B. Huang, N. Sunderland // Ann. Bot. - 1982. - v. 4. - P. 89-104. 7. Szarejko J. Anther culture for doubled haploid production in barley (Hordeum vulgare L.) / J. Szarejko // Doubled haploid production in cropplants / Ad. M. Maluszynski, K. J. Kasha, B. P. Forster, I. Szarejko. - Dordrecht: Kluwer academic publishers, 2003. - P. 35-42. 8. Chu C.-C. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops / C.-C. Chu // Plant Tissue Culture: Proc. Symp. - Peking: Science Press, 1978. - P. 43-45. 9. Murashige Т., Skoog F. Arevised medium forgrow than dbioassays with tobaccotissue cultures / T. Murashige., F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - v. 15. - P. 473-497. 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 Спосіб обробки рослинного матеріалу для отримання гаплоїдів ячменю ярого у культурі пиляків in vitro, який включає довготривале зберігання колосся в умовах низької плюсової температури, вилучення пиляків і отримання гаплоїдних рослин, який відрізняється тим, що на зберігання закладають колосся, отримане з пагонів, попередньо витриманих у воді впродовж п'яти діб при температурі 4 °C, після чого вилучене з листової піхви колосся піддають стерилізації, видаляють ості і вміщують у стерильні ємкості з високим рівнем відносної вологості та зберігають впродовж 22-28 діб при температурі 4 °C. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3