Штучне живильне середовище для отримання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro

Реферат: Штучне живильне середовище для отримання гаплоїдів ячменю, в якому як гелеутворювач використовують крохмаль природного мутанту гороху r. UA 103426 C2 (12) UA 103426 C2 UA 103426 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі сільського господарства, а саме - до живильних середовищ, які використовуються для отримання гаплоїдів ярого ячменю в культурі пиляків in vitro. Відомі штучні живильні середовища для отримання гаплоїдів рослин з мікроспор у культурі пиляків in vitro, гелеутворюючим компонентом яких є гетерополісахасарид агар-агар [1]. Однак він потребує високого ступеню очищення, не завжди забезпечує високу результативність формування макроструктур, може сприяти вітрифікації рослин-регенерантів [2]. Ці недоліки агар-агару частково усуває використання як гелеутворювача живильних середовищ хімічно модифікованого крохмалю ДККмод [3]. Використання хімічно модифікованого крохмалю ДКК мод викликає зменшення кількості андрогенних структур, але сприяє переважанню серед них ембріоїдів, підвищує частоту регенерації рослин і їх життєздатність за рахунок зниження ступеню вітрифікації [4]. Недоліками крохмалю ДККмод є необхідність проведення екологічно небезпечної процедури його хімічної модифікації, швидке (в середньому через 12-14 діб) висихання і розтріскування гелю і пригнічення процесів індукції морфогенних структур у готових середовищах на основі цього гелеутворювача. Найбільш близьким за технічною суттю до запропонованого винаходу є штучне живильне середовище, гелеутворюючим компонентом якого є зерновий крохмаль природного мутанту кукурудзи su2 з вмістом амілози в крохмалі 40-42 % [5]. Його застосування дозволяє підвищити частоту морфогенних новоутворень - ембріоїдів і ембріогенного калусу, збільшити частоту регенерації рослин, подовжити термін використання штучного живильного середовища, поліпшити його структурно-механічні властивості, спростити процедуру отримання гелеутворювача, підвищити її екологічну безпечність і знизити вартість готового продукту. Основним недоліком є складна процедура виділення крохмалю з зерна кукурудзи, і, зокрема, відокремлення крохмалю від білка, який представлено, головним чином, спирторозчинною фракцією [6]. Окрім того вирощування джерел мутації кукурудзи su2 потребує їх суворої просторової ізоляції від інших типів кукурудзи [7]. Задачею запропонованого винаходу є розробка живильного середовища, яке забезпечує підвищену результативність культури пиляків ярого ячменю in vitro і вирізняється покращеними структурно-механічними властивостями, подовженими термінами використання і спрощеною процедурою виготовлення. Поставлена задача досягається шляхом використання живильного середовища, в якому як гелеутворюючий компонент застосовують зерновий крохмаль природного мутанту гороху r з вмістом амілози в крохмалі 60-65 % у діапазоні концентрації від 62 г/л до 68 г/л. Суть винаходу полягає в тому, що на відміну від прототипу до складу живильного середовища замість високоамілозного зернового крохмалю мутанту кукурудзи su2, який важко відокремлюється від спирторозчинного білка, входить високоамілозний крохмаль мутанту гороху r, зернові білки якого складаються, в основному, з соле- і водорозчинних фракцій, що значно спрощує відділення крохмалю від білка, дозволяє отримати чистіші препарати крохмалю і знижує витрати на процедуру його виділення. Важливою перевагою запропонованого винаходу порівняно з прототипом є й те, що горох як самозапильна культура не потребує просторової ізоляції від інших посівів гороху при вирощуванні джерел мутації r [8]. Окрім того, крохмаль високоамілозного мутанту гороху r у діапазоні концентрації від 62 г/л до 68 г/л на відміну від крохмалю мутанту кукурудзи su2 практично не утворює клейстеру і у вигляді суспензії набагато легше переноситься у культуральні посудини, без залишків на їх стінках, що важливо для спостережень за ростом і розвитком культури in vitro. При застиганні суспензії крохмалю мутанту гороху r утворюється пружний гель із подовженим терміном використання, який у складі живильного середовища для культивування in vitro пиляків ярого ячменю забезпечує високу частоту індукції андрогенних структур і регенерації зелених рослин. Порівняні характеристики гелеутворюючих властивостей живильних середовищ на основі агарагару, хімічно модифікованого крохмалю, крохмалю з зерна мутанту кукурудзи su2 і мутанту гороху r наведено у таблиці 1. Отримані характеристики свідчать, що крохмаль із зерна природного мутанту гороху r за всіма проаналізованими гелеутворюючими властивостями не поступається агар-агару та крохмалю з зерна природного мутанту кукурудзи su2, а за структурою, стабільністю та водоутримуючою здатністю переважає хімічно модифікований крохмаль, особливо в період з 15 по 30 добу після утворення гелю. Запропоноване як винахід живильне середовище, зберігає стабільну желеподібну структуру без висихання та розтріскування протягом принаймні 30 діб з моменту виготовлення, що є цілком достатнім терміном для індукції андрогенних структур у культурі in vitro пиляків ярого ячменю. Порівняні оцінки результативності культури in vitro пиляків ярого ячменю при використанні як гелеутворювача живильного середовища NMS(arap) - агар-агару (0,8 %, "Difco", США), NMSsu2 1 UA 103426 C2 5 10 кукурудзяного крохмалю амілозного типу з зерна природного мутанту кукурудзи su 2 (6,5 %, мутація su2) і NMSrr - крохмалю амілозного типу з зерна природного мутанту гороху r (6,5 %, мутація rugosus) наведено на Фіг. 1 і Фіг. 2. Ці оцінки свідчать, що на середовищі, у складі якого як гелеутворювач використовували крохмаль із зерна природного мутанту гороху r було отримано істотно вищу частоту морфогенних пиляків (Фіг. 1), ніж на середовищі, яке містило крохмаль природного мутанту кукурудзи su2. За частотою регенерації зелених рослин (Фіг. 2) крохмаль гороху як гелеутворювач живильного середовища не поступався крохмалю кукурудзи при тенденції до зростання цього показника на середовищі з гороховим крохмалем. Обидва крохмалі незалежно від джерела отримання були кращими гелеутворювачами порівняно з агар-агаром. Таблиця 1 Гелеутворюючі властивості штучних живильних середовищ на основі різних полісахаридів Варіанти живильних середовищ на основі на основі Характеристики Термін на основі хімічно крохмалю крохмалю на основі гелю використання модифікованого природного природного агар-агару крохмалю мутанту мутанту кукурудзи su2 гороху r на момент молочноутворення безбарвний молочно-білий молочно-білий білий гелю Колір молочно15 діб безбарвний молочно-білий молочно-білий білий молочно30 діб безбарвний молочно-білий молочно-білий білий на момент утворення прозорий непрозорий непрозорий непрозорий гелю Прозорість 15 діб прозорий непрозорий непрозорий непрозорий 30 діб прозорий непрозорий непрозорий непрозорий на момент еластична, еластична, еластична, еластична, утворення пружна, без пружна, без пружна, без пружна, без гелю шпарин шпарин шпарин шпарин мало еластична, еластична, еластична, еластична, непружна, із 15 діб пружна, без пружна, без пружна, без шпаринами на Структура шпарин шпарин шпарин поверхні мало еластична, еластична, непружна, із еластична, еластична, 30 діб пружна, без шпаринами на пружна, без пружна, без шпарин поверхні та в шпарин шпарин товщі гелю на момент утворення висока висока висока висока гелю Стабільність 15 діб висока середня висока висока 30 діб висока низька висока висока на момент утворення висока висока висока висока Водогелю утримуюча здатність 15 діб висока середня висока висока 30 діб висока низька висока висока 15 Таким чином, запропоноване технічне рішення дозволяє підвищити ефективність отримання гаплоїдів ярого ячменю в культурі пиляків in vitro за рахунок збільшення частоти морфогенних пиляків і регенерації рослин шляхом застосування гелеутворювача з покращеними структурномеханічними властивостями і спрощеною процедурою виготовлення. 2 UA 103426 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Приклад отримання гаплоїдів ярого ячменю в культурі пиляків in vitro з використанням живильного середовища на основі крохмалю з зерна природного мутанту гороху r. Виділення крохмалю. Тонко розмелене зерно природного мутанту гороху r заливають п'ятикратним об'ємом 1 М водного розчину хлориду натрію і екстрагують білки при постійному перемішуванні суспензії і кімнатній температурі протягом 1 години. Суміші дають відстоятися, верхній рідкий шар - відкидають. Процедуру повторюють тричі, після чого осад двічі промивають надлишком бідистильованої води. Отриманий препарат крохмалю підсушують при 30±1 °C протягом 12 годин. Приготування живильного середовища. До складу живильного середовища NMSмoд.2 [9], для культивування пиляків in vitro та індукції андрогенних структур водять макроелементи середовища N 6 [10], мікроелементи середовища MS [11] і такі компоненти в мг/л: 2,4-Д - 2 (2,4дихлорфеноксіоцтова кислота); БАЛ (6-бензиламінопурін) - 0,5; В] - 1; В6 і РР - по 0,5; гліцин - 2; аланін і пролін - по 100; глутамін - 200; лактальбумін - 300; міо-інозитол - 100; а також мальтозу - 90 г/л; картопляний екстракт -20 % від об'єму. Всі компоненти живильного середовища, окрім крохмалю, розчиняють в потрібних концентраціях в бідистильованій воді. Половину отриманого розчину переносять до окремої скляної колби або хімічного стакану і нагрівають до 50-60 °C. До іншої половини розчину компонентів живильного середовища додають крохмаль із зерна мутанту гороху r з розрахунку 65 г/л і ретельно перемішують до стану гомогенної суспензії. Суспензію тонкою цівкою переносять до нагрітого розчину компонентів живильного середовища, нагрівають суміш до температури кипіння при постійному перемішуванні і негайно розливають по пробірках або 3 колбах об'ємом 50-100 см і піддають стерилізації в автоклаві при температурі 120±2 °C і тиску 78 кПа протягом 20 хвилин. Після стерилізації середовище охолоджують до кімнатної температури і залишають для гелеутворення протягом 12 годин і далі використовують для отримання гаплоїдів ячменю. Отримання гаплоїдів ячменю у культурі пиляків in vitro. Рослини ярого ячменю вирощують у польових умовах і добирають з них колосся, яке містить пиляки з мікроспорами у середній та пізній фазі розвитку. Попередню обробку колосся проводять, вміщуючи пагони у воду і витримуючи їх впродовж 5-6 діб при температурі 4 °C у холодильнику. Асептичну культуру пиляків отримують за описаною методикою [12]. Чашки Петрі і пробірки з висадженими на індукційне живильне середовище пиляками вміщують у термостат і інкубують при температурі 24 °C впродовж 30-35 діб. Отримані андрогенні структури - калюс та ембріоїди - пересаджують на регенераційне живильне середовище Р: мінеральна основа MS, вітаміни Bj, Вб і РР - по 0,5 мг/л; глутамін, міоінозітол по - 100 мг/л; сахароза - 30 г/л; агар-агар - 0,8 % ("Difco", США). Регенерацію проводять при освітленні 4-5 клк, фотоперіоді 16 годин і температурі 22-24 °C. Рослини, отримані на індукційному середовищі шляхом проростання ембріоїдів, культивують на мінімальному середовищі MS. Джерела інформації: 1. Clapham P. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro // Z. Pflanzenzucht.-1973. - V. 69. - P. 142-155. 2. Kohlenbach H.W., Wernike W, Investigation on the inhibitory effect of agar and the function of active carbon in anther culture // Ztsch. Pflanzenphysiol.-1978. -V. 86. - P. 463-472. 7 3. Патент № 52031, Україна, МПК , С08В31/02, A01N57/00, A01N59/00, A01C1/06. Спосіб отримання полімерних матеріалів / П.Г. Дульнєв, СІ. Кондратенко, Т.В. Чернишенко, В.П. Мірошниченко, Т.В. Івченко, С А. Гончарова. - Опубл. 16.12.2002, Бюл. № 12. 4. Белинская Е.В., Дульнев П.Г. Модифицированный крахмал ДКК мод. как компонент питательной среды для получения гаплоидов ячменя в культуре пыльников // Физиология и биохимия культурных растений.-2007.-т. 39, № 2.-С.-С. 136-143. 5. Патент № 42192, Україна, МПК, A01G 7/00, C12N 5/00. Спосіб підвищення виходу зелених рослин- регенерантів ячменю у культурі пиляків in vitro / Білинська О.В., Тимчук СМ., Дульнев П.Г., Деребізова О.Ю.- Опубл. 25.06.2009, Бюл. № 12. 6. Рихтер М., Аугустат 3., Ширбаум К. Избранные методы исследования крахмала. - М.: Пищевая промышленность, 1975.-183 с. nd 7. Boyer CD., Hannah L.C Kernel mutants of corn // Specialty corns / A. R. Hallauer ed.-2 ed.Boca Raton-London-New-York-Washington, D.C: CRC Press, 2001.-P.8-47. 8. Wang T. L., Hedley С L. Genetic and developmental analysis of the seed // Peas: genetics, molecular biology and biotechnology / R. Casey, D. R.Davies Eds.- Wallingford: CAB Int., 1993.- P. 83-120. 3 UA 103426 C2 5 9. Белинская Е.В. Влияние предобработки колосьев на эффективность индукции гаплоидов ячменя в культуре пыльников in vitro II Физиология и биохимия культурных растений.-2005. - т. 37, № 5. - С. 436-442. 10. Chu С.-С. The N6 medium and its application to anther culture of cereal crops // Plant Tissue Culture: Proc. Symp. - Peking: Science Press, 1978. - P. 43-45. 11. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant.-1962. - v. 15. - P. 473-497. 12.БІлинська О. В. Генотипові особливості індукції гаплоїдів ячменю (H. vulgare L.) методом культури пиляків in vitro: Автореф. дис. … канд. біол. наук. - Харків: 199.7.-19 с. 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 Штучне живильне середовище для отримання гаплоїдів ячменю в культурі пиляків in vitro, яке складається з солей макроелементів та мікроелементів, вітамінів, амінокислот, фітогормонів, вуглеводів, картопляного екстракту, гелеутворювача, яке відрізняється тим, що як гелеутворювач використовують крохмаль природного мутанту гороху r у концентрації 62-68 г/л. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4