Спосіб генотипування свиней на основі мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами

Реферат: Винахід належить способу генотипування свиней на основі мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами, що передбачає використання специфічних олігонуклеотидних праймерів, які дозволяють отримувати продукти ампліфікації мікросателітних локусів розміром від 84 до 220 пар нуклеотидів. UA 114145 C2 UA 114145 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до молекулярної біології, біотехнології, генетики та селекції тварин. Він може бути використаний в дослідницькій роботі та прикладних генетичних експертизах. Ефективність селекції у тваринництві, і свинарстві зокрема, значною мірою залежить від точності визначення походження (батьківства), яке гарантує об'єктивність племінної роботи. Аналіз молекулярної структури геному вищих організмів довів, що найбільш варіабельною є високоповторювана фракція геному, яка часто ототожнюється з сателітною ДНК. Найчастіше для визначення батьківства використовують мінісателітну та мікросателітну ДНК [1]. Історично склалося, що для дослідження використовують мікросателітні маркери з динуклеотидними повторами. Недоліком мікросателітних маркерів з динуклеотидними повторами є утворення неспецифічних (статорних) продуктів ампліфікації, що утворюються за рахунок помилок ДНКполімерази. Іншим недоліком є складність електрофоретичного фракціонування та однозначного генотипування свиней за динуклеотидними повторами. Задачею винаходу є розробка способу дослідження тварин за мікросателітними маркерами з тетрануклеотидними повторами, що забезпечують ДНК-типування в умовах, що не вимагають великих матеріальних затрат. В основу винаходу поставлено метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР - це циклічний процес, кожний цикл якого складається з трьох етапів: 1) денатурація нуклеїнової кислоти, що досліджується; 2) ренатурація нуклеїнової кислоти з олігонуклеотидними праймерами, що обмежують ампліфіковану ділянку; 3) синтез обмеженої праймерами ділянки ДНК до рівня виявлення. Тривалість циклу 1,5-3 хвилини, а число циклів, залежно від кількості вихідного матеріалу - від 30 до 40. Ключовим параметром, що визначає специфічність та чутливість ПЛР є "якість" праймерів: ступінь їх гомології з ДНК матрицею, відсутність взаємної та неспецифічної ренатурації; поліморфізм довжини ампліфікованих фрагментів (ПДАФ) та електрофоретичного фракціонування продуктів ампліфікації в денатуруючому поліакріламідному гелі. Поставлена задача вирішується шляхом ДНК-типування свиней за локусами мікросателітної ДНК з тетрануклеотидними повторами, зокрема FH3628, локалізований на 16 хромосомі геному свині (SSC16), FH1865 - (SSC1), FH4219 - (SSC6), FH1885 - (SSC7), FH3764 - (SSC6), FH4231 (SSC15), FH1589 - (SSC3), FH1810 - (SSC5) та FH3637 - (SSC11). Локуси FH3628, FH4219, FH3764, FH4231, FH1589, FH3637 мають повтор типу (GAAA) n, а локуси FH1865, FH1885 та FH1810 мають повтор типу (GATA) n. Кількість повторів є причиною виникнення різних алельних варіантів. Аналогом пропонованого винаходу є методи типування за мікросателітними локусами з динуклеотидними повторами [2]. Прототипом методу є типування тварин за мікросателітними локусами з тетрануклеотидними повторами з розміром ампліфікацій них фрагментів від 248 до 547 пар нуклеотидів [3]. Недоліки аналогічних методів: висока вартість реагентів та обладнання, так званих сиквенаторів. Пропонований спосіб генотипування свиней на основі мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами має наступні переваги: низька вартість реагентів та обладнання, при аналогічній інформативності. Можливість здійснення винаходу, що заявляється, підтверджується власними дослідженнями - аналіз ДНК різних тварин на основі мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами показав можливість використання гелів з довжиною пробігу 20 см. До того ж є можливість використовувати дані локуси в трьох мультиплексах (триплексах) коли ампліфікуються відразу три локуси в одній пробірці. Етапи дослідження включають наступні пункти: 1. Отримують біоматеріал (кров, щетина, сперма, тканини) від об'єкта дослідження. 2. Виділяють ДНК з біоматеріалу. 3. Здійснюють полімеразну ланцюгову реакцію для збільшення копій ділянки ДНК за допомогою специфічних праймерів. Структура специфічних праймерів: FH3628 прямий праймер: 5'-GGCAATGGAGTGACTGTG-3', зворотний праймер: 5'-GCTTTATACAACTTAGGAAGCCCA-3', FH1865 прямий праймер: 5'-TGCCTATCCCTCCTGGAG-3', 1 UA 114145 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 зворотний праймер: 5'-TGCCACTATGCTCAGCAC-3', FH4219 прямий праймер: 5'-CACATGCTGTGGGAGCAACC-3', зворотний праймер: 5'-GCTCAGTAAGCCTAGGTAGG-3', FH1885 прямий праймер: 5'-GCCCTGGTTAAGAAAGCAAGTCC-3', зворотний праймер: 5'-ACACCTTTCAGAGGAATCTTGCCA-3', FH3764 прямий праймер: 5'-GTCACAGGTGTGGCCCTA-3', зворотний праймер: 5'-ACTACATCTTGGGCAAAGTG-3', FH4231 прямий праймер: 5'-ACCTCCATATGCTGTGGGT-3', зворотний праймер: 5'-AATGCAGAAGGGCTCACTCTT-3', FH1589 прямий праймер: 5'-CCACTGAGAGGGCAGTGTGACC-3', зворотний праймер: 5'-GGAATTGGGTAGAAGTTCGTGGGC-3', FH1810 прямий праймер: 5'-GAGATGATATGGCAAACCCAGTA-3', зворотний праймер: 5'-AGGACTGCACCCACGGCATAT-3', FH3637 прямий праймер: 5'-CGAGAATGCCACACGTTAGCA-3', зворотний праймер: 5'-CCCTGGCTTGGGAATTTGCAT-3'. Схема полімеразної ланцюгової реакції: Перший цикл ПЛР 94 °C 3 хв.; наступні 35 циклів 94 °C-30 сек., 60 °C-30 сек., 72 °C-30 сек.; та останній 72 °C-5 хв. 4. Розділяють отримані фрагменти в 8 % денатуруючому поліакріламідному гелі з довжиною пробігу 20 см і фарбують бромистим етидієм. Переглядають в ультрафіолетовому світлі та фотодокументують. 5. Аналізують результати досліджень. Фрагменти, що утворилися порівнюють з стандартами молекулярного розміру та визначають генотипи, які мають бути розміром від 84 до 220 пар нуклеотидів. Мікросателітні локуси з тетрануклеотидними повторами є одним з найважливіших інструментів визначення походження та ідентифікації тварин. Результати досліджень вказують на те, що використання для встановлення походження мікросателітних локусів з тетрануклеотидними повторами мають низьку вартість реагентів та обладнання при аналогічній інформативності. Аналіз різних особин з використанням мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами показав наявність різних алельних варіантів, та отже можливість використовувати ці локуси для встановлення походження та ідентифікації. Джерела інформації: 1. Використання аналізу ДНК у судово-медичних експертизах / за редакцією Ю.М. Сиволапа та Г.Ф. Кривди. - Одеса: Одес. мед. ун-т, 2001. - 92 с. 2. Putnová L. A novel porcine microsatellite panel for the identification of individuals and parentage control in the Czech Republic / L. Putnová, A. Knoll, V. Dvořák, J. Dvořák // Czech J. Anim. Sci. - 2003. - Vol. 48. - P. 307-314. 3. Laval G. Genetic diversity of eleven European pig breeds / G. Laval, N. Iannuccelli, Chr. Legault et al. // Genet. Sel. Evol. - 2000. - Vol. 32. - P. 187-203. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 50 55 60 Спосіб генотипування свиней на основі мікросателітних маркерів з тетрануклеотидними повторами, який відрізняється тим, що специфічними олігонуклеотидними праймерами, що дозволяють отримувати продукти ампліфікації мікросателітних локусів від 84 до 220 пар нуклеотидів, є: FH3628 прямий праймер: 5'-GGCAATGGAGTGACTGTG-3', зворотний праймер: 5'-GCTTTATACAACTTAGGAAGCCCA-3', FH1865 прямий праймер: 5'-TGCCTATCCCTCCTGGAG-3', зворотний праймер: 5'-TGCCACTATGCTCAGCAC-3', FH4219 2 UA 114145 C2 5 10 15 20 прямий праймер: 5'-CACATGCTGTGGGAGCAACC-3', зворотний праймер: 5'-GCTCAGTAAGCCTAGGTAGG-3', FH1885 прямий праймер: 5'-GCCCTGGTTAAGAAAGCAAGTCC-3', зворотний праймер: 5'-ACACCTTTCAGAGGAATCTTGCCA-3', FH3764 прямий праймер: 5'-GTCACAGGTGTGGCCCTA-3', зворотний праймер: 5'-ACTACATCTTGGGCAAAGTG-3', FH4231 прямий праймер: 5'-ACCTCCATATGCTGTGGGT-3', зворотний праймер: 5'-AATGCAGAAGGGCTCACTCTT-3', FH1589 прямий праймер: 5'-CCACTGAGAGGGCAGTGTGACC-3', зворотний праймер: 5'-GGAATTGGGTAGAAGTTCGTGGGC-3', FH1810 прямий праймер: 5'-GAGATGATATGGCAAACCCAGTA-3', зворотний праймер: 5'-AGGACTGCACCCACGGCATAT-3', FH3637 прямий праймер: 5'-CGAGAATGCCACACGTTAGCA-3', зворотний праймер: 5'-CCCTGGCTTGGGAATTTGCAT-3'. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3