Спосіб кріоконсервування сперми осетрових риб

Реферат: Винахід належить до рибництва і може бути використаний при штучному заплідненні та збереженні генофонду осетрових риб. Заявлено спосіб кріоконсервування сперми осетрових риб, який включає розведення сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить 8,9-10 мМ КНС03, 3,8-7,6 мМ моногідрату креатину, 10,5-11,7 мМ сахарози, 5,0-5,6 мМ фруктози та 3,0-3,75 М метанолу. Розведену сперму заморожують у гранулах від 5 °C до -15 °C зі швидкістю 2-5 °C/хв. з використанням сидингу при -4 °C, від -15 C до -70 °C зі швидкістю 15-20 °C/хв., з наступним зануренням у рідкий азот. UA 115006 C2 (12) UA 115006 C2 UA 115006 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до рибництва і може бути використаний при штучному заплідненні та збереженні генофонду осетрових риб. Відомий спосіб кріоконсервування сперми риб, який включає розведення сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить 65 % 0,2 М трис-НСІ-буфера, 10 % курячого жовтка та 25 % диметилсульфоксиду, і наступне заморожування. Заморожування проводять в ампулах зі швидкістю 0,5-5 °C/хв. до -12…-14 °C, а потім зі швидкістю 20-30 °C/хв. до температури рідкого азоту -196 °C [1]. Недоліком способу є низька запліднююча здатність розмороженої сперми, яка в середньому не перевищує 60 % при використанні якісної сперми. Відомий спосіб кріоконсервування сперми сибірського осетра, який включає розведення сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить 30 мМ трис-оксиметил-амінометану, 23,4 мМ сахарози, 0,25 мМ КСl, НСІ до рН 8,0, 10 % метанолу, і заморожування в соломинках об'ємом 1,2 мл. Заморожування проводять зі швидкістю 3,5 °C/хв. від 4 °C до -15 °C з сидингом при 7 °C, переносять на 5 хв. на сухий лід із наступним зануренням у рідкий азот. [2]. Недоліком способу є неможливість використання кріоконсервованої сперми для запліднення великих об'ємів ікри. Після запліднення 1г ікри розмороженою спермою отримують лише 29,6±5,0 % мальків. Це не дозволяє використовувати спосіб в промислових масштабах. Відомий спосіб кріоконсервування сперми стерляді, який включає розведення 1:1 кріозахисним розчином, що містить 50 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 10 мМ триса (рН 8,5), 7,5 % метанолу, і заморожування в пластикових соломинках шляхом 3 хв. витримки на висоті 3 см над поверхнею азоту з подальшим зануренням у рідкий азот [3]. Недоліком способу є зниження рухливості розморожених сперматозоїдів та неможливість запліднення великих об'ємів ікри: з 2-х г ікри запліднюється 32,7±4,4 %. Найбільш близьким до заявленого способу є спосіб кріоконсервування сперми осетрових риб, який включає розведення охолодженої до 15 °C сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить компоненти у такому співвідношенні, мас %: 0,05-0,5 сахарози; 0,01-0,15 хлориду калію; 6-12 метанолу; 0,05-5 гліцерину; решта - дистильовану воду. Після 60 хв. еквілібрації сперми при 0-5 °C її заморожують в хлорвінілових ампулах по 1,5 мл зі швидкістю 2-5 °C/хв. від 5 до 15 °C, від -15 до -70 °C зі швидкістю 10-20 °C/хв., потім занурюють в рідкий азот [4]. Недоліком способу є низька рухливість розмороженої сперми. За даними авторів при використанні сперми стерляді запліднюється в середньому 73,8 % малих об'ємів ікри. При використанні сперми сибірського осетра запліднюється в середньому лише 62,2 % ікри при більших об'ємах ікри (100-300 г) і сперми (3-18 мл). В основу винаходу поставлена задача створити такий спосіб кріоконсервування сперми осетрових риб, який би за рахунок зміни кріозахисного розчину і режиму заморожування забезпечив підвищення рухливості, а також можливість запліднення великих об'ємів ікри. Ця задача вирішується тим, що в способі кріоконсервування сперми осетрових риб, який включає розведення сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить сахарозу і метанол, та заморожування від 5 до -15 °C зі швидкістю 2-5 °C/хв, потім від -15 до -70 °C зі швидкістю 1020 °C/хв з подальшим зануренням у рідкий азот, згідно з винаходом, в кріозахисний розчин додатково вводять гідрокарбонат калію (КНСО 3), моногідрат креатину і фруктозу, при цьому заморожування від 5 °C до -15 °C проводять з використанням сидингу при -4 °C. Сперму заморожують у вигляді гранул. Компоненти кріозахисного розчину беруть в такому співвідношенні: 8,9-10 мМ КНСО3, 3,8-7,6 мМ моногідрату креатину, 5-5,6 мМ фруктози. Введення в кріозахисний розчин КНСО3, моногідрату креатину та фруктози дозволяє зупинити активацію сперматозоїдів під час розбавлення кріозахисним розчином та відновити її рухливість під час запліднення. Заморожування сперми в гранулах з використанням сидингу при -4 °C дозволяє отримати ідентичний режим охолодження для всіх гранул. Покращені умови кріоконсервування забезпечують підвищення рухливості розмороженої сперми до 75-80 %, а її запліднюючої здатності в середньому до 85,8 % з використанням в 3 рази меншої кількості сперми при заплідненні великих об'ємів ікри, що на 23,4 % вище, ніж у прототипі. Приклад здійснення способу. Для дослідів використовували сперму стерляді, яку охолоджували до 5 °C, розбавляли 1:1 ізотермічним кріозахисним розчином, до складу якого входять 8,9-10 мМ КНСО3, 3,8-7,6 мМ моногідрат креатину, 10,5-11,7 мМ сахарози, 5,0-5,6 мМ фруктози та 3,0-3,75 М метанолу, і автоматичною мікропіпеткою по 100 мкл переносили на пластину в парах азоту при 5 °C. Потім її відразу ж заморожували від 5 °C до -15 °C зі швидкістю 2-5 °C/хв. з сидингом при -4 °C, від 15 °C до -70 °C зі швидкістю 15-20 °C/хв., далі гранули занурювали в рідкий азот. Розморожували у водяній бані і активували у ставковій воді. Рухливість сперми оцінювали візуально під мікроскопом: рухливих клітин було 75-80 %. Для визначення запліднюючої 1 UA 115006 C2 5 здатності отримували ікру масою 25, 40 і 60 г від 3 самок і до кожної порції додавали таку ж масу води та 1 мл сперми і перемішували 3 хв. Потім для попередження склеювання ікри її промивали 0,6 % розчином таніну. Подальшу інкубацію ікри проводили в промислових інкубаційних апаратах. В контролі до ікри додавали свіжу сперму. Запліднюючу здатність сперми оцінювали на стадії 4-х бластомерів. Отримані результати наведені в Таблиці 3. Таблиці видно, що кріоконсервування майже не вплинуло на запліднюючу здатність розмороженої сперми, яка в середньому була на 2 % нижчою ніж в контролі, і на 23,4 % вищою, ніж у прототипі, незалежно від самки та об'єму взятої ікри. Таблиця Рухливість та запліднююча здатність сперми до (контроль) та після кріоконсервування Вид риб Стерлядь (контроль) Стерлядь (контроль) стерлядь стерлядь стерлядь стерлядь стерлядь стерлядь сибірський осетр сибірський осетр сибірський осетр сибірський осетр сибірський осетр Об'єм ікри, г Рухливість Запліднення, сперматозоїдів, % % Заявлений спосіб 80 95 87,7 90 95 Запліднення відносно контролю, % 87,5 40 60 60 25 1-2 1-2 100 100 300 300 300 75-80 75-80 75-80 75-80 Прототип * * * * * * * 85,6 87,6 79,9 89,2 97,7 100,0 91,2 101,8 82,9 64,6 50,0 69,1 58,0 58,7 75,2 73,4 101,4 76,7 77,6 99,4 * у прототипі дані відсутні 10 15 Джерела інформації: 1. А. с. СССР № 591164, А 01 К 61/00, 1978, Бюл. № 5. Способ консервирования спермы рыб. 2. Glogowski J., et al. Fertilising rate of Siberian sturgeon (Acipenser baerii, Brandt) milk cryopreserved with methanol // Aquaculture. - 2002. -V. 211. - P. 367-373. 3. Lahnsteiner F., et al. Studies on the semen biology and sperm cryopreservation in the sterlet, Acipenser ruthenus L // Aquaculture Research. - 2004. -V. 35, N 6. -P. 519-528. 4. Патент РФ № 2 317 703, A01K 61/00, A01N 1/02, 2008, Бюл. № 8. Способ криокснсервирования спермы осетровых рыб. 20 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 25 30 1. Спосіб кріоконсервування сперми осетрових риб, який включає розведення сперми 1:1 кріозахисним розчином, що містить сахарозу і метанол, та заморожування від 5 °C до -15 °C зі швидкістю 2-5 °C/хв., від -15 °C до -70 °C зі швидкістю 15-20 °C/хв., з подальшим зануренням в рідкий азот, який відрізняється тим, що в кріозахисний розчин додатково вводять гідрокарбонат калію, моногідрат креатину і фруктозу, заморожують сперму в гранулах, а заморожування від 5 °C до -15 °C здійснюють з використанням сидингу при -4 °C. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що компоненти кріозахисного розчину беруть в такому співвідношенні: гідрокарбонат калію 8,9-10 мМ моногідрат креатину 3,8-7,6 мМ сахароза 10,5-11,7 мМ фруктоза 5,0-5,6 мМ метанол 3,0-3,75 М. 2 UA 115006 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3