Застосування водорозчинних немодифікованих с60 фулеренів як ефективних блокаторів рецептор-керованих trp-каналів у гладеньких м’язах кишечнику

Реферат: Застосування водорозчинних немодифікованих С60 фулеренів за мікромолярної концентрації як засобу блокування рецептор-керованих катіонних каналів родини TRP у гладеньких м'язах кишечнику, що уможливлює їх використання для корекції гіперактивності моторики шлунковокишкового тракту. UA 115470 C2 (12) UA 115470 C2 UA 115470 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузей біотехнології, медицини та фармакології і стосується розробки засобу блокування рецептор-керованих катіонних каналів родини TRP у гладеньких м'язах (ГМ) кишечнику, що уможливлює їх використання для корекції гіперактивності моторики шлунковокишкового тракту. TRP-канали, розташовані у плазматичній мембрані різних типів клітин, мають відносно невибіркову селективність для катіонів, зокрема іонів натрію, калію, кальцію і магнію [1]. У ГМ кишечнику переважно експресовані ТRРС4/С6-канали (одна з підродин TRP), які є мішенями дії збуджуючих нейротрансмітерів і подальшої каскадної сигналізації через G-білки, що лежить в основі холінергічної деполяризації ГМ. Водночас, селективні блокатори ТRРС4/С6-каналів залишаються малодослідженими [2]. Створення нових селективних блокаторів цих каналів, зокрема на основі біодоступних, біосумісних і нетоксичних наноструктур, є надзвичайно актуальною прикладною проблемою, оскільки уможливлює їх цілеспрямоване застосування для корекції різних порушень нормальної функції кишечнику (наприклад, поширений синдром подразненого кишечнику, запальні процеси тощо), які супроводжуються гіперактивністю ГМ. Відомі аналоги теоретичного моделювання - поодинока молекула С60 фулерену, яка здатна ефективно блокувати калієві канали [3] та С84 фулерeн, до поверхні якого рівномірно приєднані шість похідних лізину, який є селективним блокатором потенціал-залежних натрієвих каналів [4]. Однак, реалізувати на практиці селективну взаємодію окремих синтетичних молекул з іонними каналами досить важко, оскільки зазвичай при їх переведенні у біодоступну розчинну форму утворюються їх агрегати (кластери) [5, 6]. Задача винаходу полягає у розробці технології застосування водорозчинних немодифікованих С60 фулеренів як ефективних терапевтичних засобів регулювання рецепторкерованих катіонних струмів через ТRРС4/С6-канали в ізольованих міоцитах тонкого кишечнику (мускаринового катіонного струму). Суть винаходу полягає у тому, що тут вперше пропонується застосовувати водорозчинні немодифіковані С60 фулерени як ефективні блокатори неселективних катіонних TRPC4/C6каналів, які опосередковують нейрогенне холінергічне збудження і скорочення ГМ шлунковокишкового тракту за природних умов. Додатково суть винаходу пояснюють ілюстрації: Фіг. 1, де представлено блокування mlcat-струму за дії водорозчинних немодифікованих С 60 -6 фулеренів (10 М) на прикладі однієї клітини (постійна часу інгібування струму складає 212 с). Фіг. 2, де показана вольт-амперна характеристика mIcat-струму, який вимірювали за допомогою повільного "пилкоподібного" протоколу до і після аплікації препарату: 1 контрольний mIcat-струм; 2 - вилив препарату. Приклад реалізації винаходу. Проведені in vitro біологічні дослідження водорозчинних немодифікованих С60 фулеренів [5, 6] показали, що за низьких (фізіологічних) концентрацій (до -3 1,4·10 М) вони не виявляють токсичних ефектів щодо нормальних клітин [7] та здатні регулювати вільнорадикальні процеси у клітинах і тканинах організму [8], зокрема нейтралізувати надлишок вільних радикалів. Усі експериментальні процедури з лабораторними тваринами (самці мишей лінії BALB/c вагою 25-30 г) було виконано з дотриманням Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях. Експерименти проводили на ізольованих клітинах тонкого кишечнику миші. Ферментативна інкубація клітин відбувалася у розчині колагенази типу 1А (1 мг/мл), інгібітора трипсину (1 мг/мл) та бичачого альбуміну (1 мг/мл) (Sigma, США). Вплив водорозчинних немодифікованих С 60 фулеренів на іонні провідності каналів у міоцитах проводили за умов фіксації потенціалу з використанням patch clamp методу у конфігурації "ціла клітина" за допомогою петч-клемп підсилювача Axopatch 200B (Molecular Devices, США). Для ізоляції і збереження клітин використовували зовнішньоклітинний модифікований розчин Кребса такого складу: NaCl 120 мМ, глюкоза 12 мМ, HEPES 10 мМ, KСl 6 мМ, СаСl 2,5 мМ, MgCl 1,2 мМ (рН 7,4). Внутрішньоклітинний розчин містив: CsCl 80 мМ, MgAТФ 1 мМ, креатин 5 мМ, глюкоза 5 мМ, ВАРТА 10 мМ, HEPES 10 мМ, СаСl 4,6 мМ (рН 7,4). Для ізоляції катіонного струму використовували безкальцієвий та безмагнієвий зовнішньоклітинний розчин, який містив 120 мМ CsCl (рH 7,4). Активація G-білків відбувалася шляхом внутрішньоклітинної аплікації ГТФγS (200 μМ) через петч-піпетку, що спричиняло повільний розвиток mIcat-струму, який досягав максимальної амплітуди 451±52 пА при - 40 мВ (n=9) упродовж 5-10 хв. Мембранну провідність досліджували шляхом вимірювання вольтамперних характеристик mIcat з інтервалом у 30 с із застосуванням "пилкоподібного" протоколу (від 80 до -120 мВ за 6 с). Водний розчин немодифікованих С 60 -6 фулеренів (10 М) вводили на піку активації G-білками mIcat-струмів, що викликало їх 1 UA 115470 C2 5 10 15 20 25 30 35 блокування на 47,0±3,5 % (n=9) (Фіг. 1-2). Блокування струму розвивалось повільно із середньою постійною часу інгібування 119±16 с (Фіг. 1). Струм при цьому зберігав свої потенціал-залежні властивості (Фіг. 2), а блокування було незворотнім. Важливою особливістю запропонованого винаходу є те, що під час проведення тестування мускаринові рецептори, які відповідають за чисельні функції в організмі (секреція, регуляція частоти і сили серцевих скорочень тощо), не брали участі в активації mIcat-струму, оскільки TRРС4/С6-канали відкривались завдяки безпосередній активації G-білків. Це свідчить про те, ідо блокування mIlcat-струму водорозчинними немодифікованими С60 фулеренами швидше за все не спричинятиме тих побічних ефектів (наприклад, відчуття сухості в роті), які притаманні інгібуванню мускаринових рецепторів. Таким чином, технічним результатом застосування водорозчинних немодифікованих С 60 фулеренів за мікромолярної концентрації, як нового класу терапевтичних засобів, є те, що вони здатні блокувати рецептор-керовані катіонні ТRРС4/С6-канали, що уможливлює їх цілеспрямоване використання у терапії захворювань і порушень нормального функціонування травної системи, зокрема ГМ кишечнику. Джерела інформації: 1. К. Venkatachalam, С. Montell. TRP channels. Annu. Rev. Biochem., 2007, 76,387-417. 2. A.V. Zholos. Studying endogenous TRP channels in visceral and vascular smooth muscles. TRP channels Methods in Signal Transduction, CRC Press; 2011. 3. S. Kraszewski, M. Tarek, W. Treptow, C. Ramseyer. Affinity of C 60 neat fullerenes with membrane proteins: a computational study on potassium channels. ACS Nano, 2010, 4, 4158-4164. 4. T.A. Hilder, S. -H. Chung. Designing a C84 fullerene as a specific voltage-gated sodium channel blocker. Nanoscale Res. Lett., 2013, 8, 323. 5. Yu. I. Prylutskyy, V.I. Petrenko, O.I. Ivankov, O.A. Kyzyma, L.A. Bulavin, O.O. Litsis, M.P. Evstigneev, V.V. Cherepanov, A.G. Naumovets, U. Ritter. On the origin of C60 fullerene solubility in aqueous solution. Langmuir, 2014, 30, 3967-3970. 6. U. Ritter, Yu.I. Prylutskyy, M.P. Evstigneev, N.A. Davidenko, V.V. Cherepanov, A.I. Senenko, O.A. Marchenko, A.G. Naumovets. Structural features of highly stable reproducible C 60 fullerene aqueous colloid solution probed by various techniques. Fullerenes, Nanotubes, Carbon Nanostruct, 2015, 23, 530-534. 7. S.V. Prylutska, G.V. Didenko, G.P. Potebnya, K.I. Bogutska, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, P. Scharff. Toxic effect of C60 fullerene-doxorubicin complex towards normal and tumor cells in vitro. Biopolym. Cell, 2014, 30, 372-376. 8. S.V. Prylutska, I.I. Grynyuk, O.P. Matyshevska, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, P. Scharff. Antioxidant properties of C60 fullerenes in vitro. Fullerenes, Nanotubes, Carbon Nanostruct., 2008, 16, 698-705. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 40 Застосування водорозчинних немодифікованих С60 фулеренів за мікромолярної концентрації як ефективних блокаторів рецептор-керованих TRP-каналів у гладеньких м'язах кишечнику. 2 UA 115470 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3