Застосування немодифікованих фулеренів с60 як протипухлинних агентів у терапії злоякісних новоутворень

Реферат: Застосування немодифікованих фулеренів С60 як високоефективних протипухлинних агентів, що здатні проявляти як протекторну, так і інгібуючу дії у терапії злоякісних новоутворень. UA 98076 C2 (12) UA 98076 C2 UA 98076 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Винахід, що заявляється, належить до галузі експериментальної онкології і стосується застосування немодифікованих фулеренів С60 у терапії злоякісних новоутворень. Відомо, що біологічно активні водорозчинні немодифіковані фулерени С 60 є нетоксичними сполуками [1-2], проявляють мембранотропні [3] та антиоксидантні властивості [4-5] і, таким чином, слугують основою для створення нового класу перспективних лікарських препаратів протипухлинної дії. Так, модельні дослідження [6] виявили значну антиангіогенну дію похідних фулеренів С60, а саме блокування ними утворення нових мікросудин у пухлині, що перешкоджало її подальшому росту і прогресії. Автори роботи [7] показали, що наночастинки металофулеренів С60 здатні проникати крізь плазматичну мембрану пухлинних клітин, ефективно пригнічувати їхню проліферацію та знижувати активність тих ферментів, які відповідають за продукцію активних форм кисню. Але при цьому недоліками вказаних аналогів [6-7] при подальшому використанні фулеренових наноструктур у клінічній онкології є складність проведення хімічної модифікації фулеренів С60 для їх розчинення у воді і, як наслідок, зростання їх токсичності відносно нормальних клітин, а також відсутність оцінки протипухлинної активності в експериментах in vivo. В основу винаходу поставлена задача створити спосіб застосування фулеренів С60 в експериментальній онкології, які б ефективно перешкоджали/уповільнювали ріст злоякісних пухлин в системі in vivo. Поставлена задача вирішується тим, що в способі застосування фулеренів С 60 у терапії злоякісних новоутворень використовують немодифіковані (чисті) фулерени С 60, які є водорозчинними і не цитотоксичними, і, які, згідно з винаходом, за підібраних низьких терапевтичних доз та технології введення в живий організм, здатні проявляти високу протипухлинну активність. Використання немодифікованих фулеренів С60 як нових протипухлинних агентів, з одного боку, активує роботу імунної системи організму, що перешкоджає росту злоякісних пухлин (захисний ефект), а з іншого боку, викликає антиангіогенну дію, цілеспрямовано уповільнюючи ріст пухлин (пригнічуючий ефект). Суть винаходу пояснюється таким прикладом. Приклад. Водні розчини немодифікованих фулеренів С 60 (чистота 99,5 %) були отримані за методикою, яка базується на переведенні молекул С60 з толуолу у воду внаслідок обробки ультразвуком [8]. Виявилося, що цей темно-коричневий розчин є типовою колоїдною системою, яка містить як поодинокі молекули С60, так і сферичні кластери діаметром до 3 нм у гідратованому стані [9]. Встановлено [8], що найбільш енергетично вигідною структурою у такому водному кластері є клатрат С60(Н2О)60. Важливо зазначити, що дана технологія отримання водних розчинів фулеренів С60 відрізняється від способу [10], де фулерени С 60 здебільшого знаходяться в агрегатних станах розміром до 32 нм. Вихідна концентрація фулеренів С60 у водному розчині складала 1.0 мг/мл. Зображення субмоношарів плівок фулеренів С60, нанесених з водного розчину на поверхню Au(111), отримані за допомогою скануючої тунельної мікроскопії, приведені на Фіг. 1. Вони виявили розподіл фулеренових кластерів розміром до ~2,8 нм (перший стабільний сферичноподібний кластер, що складається із 13 гідратованих фулеренів С 60 [9]) уздовж кристалографічного напрямку (Фіг. 1, а). Незважаючи на високу рухливість молекул С 60 на поверхні Au(111) за кімнатної температури, вдалося зафіксувати зображення поодиноких фулеренів С60 (діаметр ~0,7 нм) (Фіг. 1, b). Миші чоловічої статі лінії C57B1/6J вагою 20-21 г утримувалися у віварії на стандартному харчовому раціоні. Середня температура у віварії дорівнювала 191 °С. Досліди з тваринами проводили з дотриманням етичних норм, затверджених Європейською комісію з утримання тварин. Середнє значення об'єму пухлини розраховували за такою формулою: V    a  b  c , де a,b і 6 c - максимальні розміри пухлини у взаємноперпендикулярних напрямках. Пригнічення росту пухлини (індекс інгібування) оцінювали за такою формулою: k 1  V0  V1  100% , де V0 і V1 V0 55 середні значення об'ємів пухлини в групі 0 (контроль) та піддослідній групі 1, наприклад. Водні розчини немодифікованих фулеренів С60 концентрацією 1,0 мг/мл в об'ємі 0,1 мл вводили внутрішньочеревно мишам чоловічої статі лінії C57B1/6J вагою 20-21 г (доза 5 мг/кг) з перещепленим внутрішньом'язово в кінцівку штамом карциноми Льюїса (рак легень) (група 1; пригнічуючий ефект). Введення фулеренів С60 починали через день після перещеплення 1 UA 98076 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пухлини, яка візуально з'являлася на 10-й день після початку перещеплення. Фулерени С 60 вводили одноразово протягом 5-ти днів з інтервалом через день з урахуванням того факту, що введені внутрішньочеревно щурам фулерени С60 (доза 500 мг/кг) виводяться з організму протягом 2-4 днів [4]. Також водні розчини немодифікованих фулеренів С 60 в об'ємі 0,1 мл вводили внутрішньочеревно мишам одноразово протягом 5-ти днів з інтервалом через день до перещеплення пухлини (група 2; захисний ефект). Нарешті, групу 0 (без введення фулеренів С60, але з перещепленою пухлиною) використовували як контроль. Початкова кількість тварин у кожній піддослідній групі в Експерименті 1 складала 5, а в Експерименті 2-7. Результати Експерименту 1 представлені в Табл. 1. Протипухлинний ефект фулеренів С60 почали реєструвати на 15-й день (05.11.2010) після перещеплення пухлини (22.10) для групи 1 (пригнічуючий ефект) та групі 2 (захисний ефект; це 25-й день після початку введення фулеренів С60 (12.10)). Пригнічення росту пухлини в групі 1 зростало від 30.0 % (15-й день), досягало максимуму 37,2 % (18-й день), а потім зменшувалося до 16,0 % (25-й день після перещеплення пухлини). Пригнічення росту пухлини в групі 2 демонструє тенденцію до зменшення від 17,0 % (15-й день) до величини 3.1 % (25-й день після перещеплення пухлини). Остання тварина у контрольній групі 0 загинула на 32-й день (22.11) від початку експерименту. Виживаність тварин у групі 1 складала 40,0 %, а в групі 2 - 20.0 % порівняно з контролем. Нарешті, тривалість життя останньої піддослідної тварини у групі 1 (пригнічуючий ефект) та групі 2 (захисний ефект) (38 днів) перевищила цей параметр для останньої тварини з контрольної групи 0 (31 день) в 1,23 разу. Результати Експерименту 2 представлені в Табл. 2. Протипухлинний ефект фулеренів С60 почали реєструвати на 13-й день (01.03.2011) після перещеплення пухлини (17.02) для групи 1 (пригнічуючий ефект) та 2 (захисний ефект; це 23-й день після початку введення фулеренів С 60 (07.02)). Пригнічення росту пухлини в групі 1 досягало максимуму 25.1 % на 16-й день після перещеплення пухлини, а потім зменшувалося до 5,0 % (27-й день). Пригнічення росту пухлини в групі 2 демонструє тенденцію до зростання (на відміну від результатів Експерименту 1) від 15.0 % (13-й день) до максимальної величини 35.0 % (27-й день після перещеплення пухлини). Остання тварина у контрольній групі 0 загинула на 30-й день (18.03) від початку експерименту. Виживаність тварин у групі 1 складала 85,7 %, а в групі 2 - 28.6 % порівняно з контролем. Нарешті, тривалість життя останньої піддослідної тварини у групі 2 (53 дні) (захисний ефект) та групі 1 (36 днів) (пригнічуючий ефект) перевищила цей параметр для останньої тварини з контрольної групи 0 (29 днів) в 1.83 та 1.24 (добре узгодження з даними Експерименту 1 для групи 1) рази, відповідно. На Фіг. 2 з метою візуального порівняння пухлинного росту представлені тварини піддослідної групи 0 (контроль; Фіг. 2, а) і групи 2 (захисний ефект; Фіг. 2, b) в Експерименті 2 (15.03., 27-й день після перещеплення пухлини). Розрахунки показують, що середній об'єм пухлини у контролі перевищує цей параметр у піддослідній групі 2 (захисний ефект) в ~1,3 рази. На Фіг. 3 з метою візуального порівняння пухлинного росту представлені тварини піддослідної групи 1 (пригнічуючий ефект; Фіг. 3, а) і групи 2 (захисний ефект; Фіг. 3, b) в Експерименті 2 (22.03., 34-й день після перещеплення пухлини). Розрахунки показують, що середній об'єм пухлини у піддослідній групі 1 (пригнічуючий ефект) перевищує цей параметр у піддослідній групі 2 (захисний ефект) в ~2 рази. Важливо також зазначити, що візуальні спостереження за піддослідними тваринами показали, що тварини групи 2 (захисний ефект) у порівняні з тваринами контрольної групи 0 і групи 1 (пригнічуючий ефект) проявляли більш високу рухливість, колір їхньої шерсті мав більш яскраво-виражений відтінок. Нарешті, тривалість життя останньої піддослідної тварини у групі 2 (захисний ефект) перевищила цей параметр для останньої тварини з групи 1 (пригнічуючий ефект) та контролю в ~1,5 та ~1,8 рази, відповідно. Отже, водорозчинні нетоксичні немодифіковані фулерени С 60 за низької загальної терапевтичної дози 25 мг/кг, з одного боку, викликають протипухлинну імунну відповідь, що супроводжується вірогідним гальмуванням об'єму пухлини карциноми легені Льюїса у мишей чоловічої статі лінії C57B1/6J (максимальний терапевтичний ефект досягав 35,0 % за індексом інгібування; максимальна виживаність тварин складала 28,6 % порівняно з контролем; максимальна тривалість життя останньої піддослідної тварини в 1,83 рази перевищила цей параметр для тварини з контрольної групи; Експеримент 2), а з іншого боку, цілеспрямовано пригнічують ріст цієї пухлини (максимальний терапевтичний ефект досягав 25,1 % за індексом інгібування; максимальна виживаність тварин складала 85,7 % порівняно з контролем; максимальна тривалість життя останньої піддослідної тварини в 1,24 рази перевищила цей параметр для тварини з контрольної групи; Експеримент 2) внаслідок блокування ними утворення нових мікросудин у пухлині. 2 UA 98076 C2 Таблиця 1 Експеримент 1: введення фулеренів С60 до перещеплення пухлини - 12.10; 14.10; 16.10; 18.10 і 20.10.2010 (група 2). Початок перещеплення пухлини - 22.10.2010. Введення фулеренів С60 після перещеплення пухлини - 24.10; 26.10; 28.10; 30.10 і 01.11.2010 (група 1). Початкова кількість тварин у кожній піддослідній групі складала 5. У дужках вказаний процент виживаності тварин Дата 05.11 08.11 10.11 12.11 15.11 17.11 22.11 25.11 29.11 Група 1 Група 0 Пригнічення росту (введення С60 після (контроль) пухлини, k1; (%) перещеплення) n=5 n=5 30.0 n=5 n=5 37.2 n=5 n=5 19.4 n=4 n=5 13.6 n=3 n=4 16.0 n=2 n=2 n=0 n=2 (40.0 %) n=1 n=0 Група 2 Пригнічення росту (введення С60 до пухлини, k2 (%) перещеплення) n=5 17.0 n=5 4.0 n=4 13.0 n=3 11.3 n=3 3.1 n=2 n=1 (20.0 %) n=1 n=0 Таблиця 2 Експеримент 2: введення фулеренів С60 до перещеплення пухлини - 07.02; 09.02; 11.02; 13.02 і 15.02.2011 (група 2). Початок перещеплення пухлини - 17.02.2011. Введення фулеренів С60 після перещеплення пухлини - 19.02; 21.02; 23.02; 25.02 і 27.02.2011 (група 1). Початкова кількість тварин у кожній піддослідній групі складала 7. У дужках вказаний процент виживаності тварин Дата 01.03 04.03 09.03 11.03 15.03 17.03 18.03 21.03 22.03 25.03 11.04 5 10 15 Група 1 Група 0 Пригнічення росту (введення С60 після (контроль) пухлини, k1; (%) перещеплення) n=7 n=7 4.0 n=7 n=7 25.1 n=7 n=7 5.4 n=4 n=7 17.0 n=2 n=6 5.0 n=2 n=6 n=0 n=6 (85.7 %) n=4 n=2 n=0 Група 2 Пригнічення росту (введення С60 до пухлини, k2 (%) перещеплення) n=7 15.0 n=7 27.2 n=7 25.0 n=7 23.3 n=6 35.0 n=3 n=2 (28,6 %) n=2 n=2 n=2 n=0 Джерела інформації: 1. S. V. Prylutska, О. Р. Matyshevska, A. A. Golub, Yu. I. Prylutskyy, G. P. Potebnya, U. Ritter, P. Scharff. Study of C60 fullerenes and C60-containing composites cytotoxicity in vitro. Mater.Sci.& Engineer. C, 2007, 27, 1121. 2. S. V. Prylutska, I. I. Grynyuk, S. M. Grebinyk, O. P. Matyshevska, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, С. Siegmund, P. Scharff. Comparative study of biological action of fullerenes С60 and carbon nanotubes in thymus cells. Mat. wiss. u. Werkstofftech., 2009, 40, 238. 3. S. V. Prylutska, O. P. Matyshevska, I. I. Grynyuk, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, P. Scharff. Biological effects of C60 fullerenes in vitro and in a model system. Моl. Cryst. Liq. Cryst., 2007, 468, 265. 4. N. Gharbi, M. Pressac, M. Hadchouel, H. Szwarc, S. R. Wilson, F. Moussa. C 60 fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no acute or subacute toxicity. Nano Lett., 2005, 5, 2578. 5. S. V. Prylutska, I. I. Grynyuk, O. P. Matyshevska, Yu. I. Prylutskyy, U. Ritter, P. Scharff. Antioxidant properties of C60 fullerenes in vitro. Fullerenes, Nanotubes, and Carbon Nanostruct, 2008,16, 698. 3 UA 98076 C2 5 10 6. S. Murugesan, S. A. Mousa, L. J. O'Connor, D. W. Lincoln, R. J. Linhardt, Carbon inhibits vascular endothelial growth factor- and fibroblast growth factor-promoted angiogenesis. FEBSLett, 2007, 557, 1157. 7. J.-J. Yin, F. Lao, P. P. Fu, W. G. Warner, Y. Zhao, P. C. Wang, Y. Qiu, B. Sun, G. Xing, J. Dong, X.-J. Liang, C. Chen. The scavenging of reactive oxygen species and the potential for cell protection by functionalized fullerene materials. Biomaterials, 2009, 30, 611. 8. P. Scharff, K. Risch, L. Carta-Abelmann, I. M. Dmytruk, M. M. Bilyi, O. A. Golub, A. V. Khavryuchenko, E. V. Buzaneva, V. L. Aksenov, M. V. Avdeev, Yu. I. Prylutskyy, S. S. Durov. Structure of C60 fullerene in water: spectroscopic data. Саrbоn, 2004, 42, 1203. 9. L. Bulavin, I. Adamenko, Yu. Prylutskyy, S. Durov, A. Graja, A. Bogucki, P. Scharff. Structure of fullerene C60 in aqueous solution. Phys.Chem.Chem.Phys., 2000,2, 1627. 10. G.V. Andrievsky, V.K. Klochkov, E.L. Karyakina, N.O. Mchedlov-Petrossyan. STUDIES OF AQUEOUS COLLOIDAL SOLUTIONS OF FULLERENE C60 BY ELECTRON MICROSCOPY. Chem.Phys.Lett., 300 (1999) 392-396. 15 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 Застосування немодифікованих фулеренів С60 у формі водних розчинів з розміром фулеренових кластерів не більше 3 нм як протипухлинних агентів у терапії злоякісних новоутворень. 4 UA 98076 C2 Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5