Спосіб ідентифікації гена стійкості pіarg

Реферат: Спосіб ідентифікації гена стійкості PlARG включає виявлення стійкого до несправжньої борошнистої роси зразка соняшнику. Здійснюють за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за мікросателітним локусом ORS 1039 та ідентифікації гена PlARG в генотипі зразка, що аналізують, за наявності в спектрі ампліфікації фрагмента ДНК розміром 190 пар нуклеотидів. UA 115650 U (54) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ ГЕНА СТІЙКОСТІ PІARG UA 115650 U UA 115650 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до використання ДНК-маркерів в селекції соняшника. Одним з найбільш загрозливих захворювань соняшника є несправжня борошниста роса (НБР). Збудник НБР соняшника - Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. & de Топі.) - облігатний патоген грибної природи. Розвиток патогенного грибу спричиняє пригнічення росту рослини соняшника, ураження кошиків і насіння. Висока економічна ефективність виробництва соняшнику призвела до перенасичення сівозмін цією культурою і, як наслідок, до формування нових вірулентних рас вказаного патогену. Шляхом добору з популяцій, отриманих у результаті інтрогресивної гібридизації культурного соняшника з представниками дикорослого виду Helianthus argophyllus L., отримані лінії, які характеризуються наявністю гена Plarg, що обумовлює універсальну стійкість проти всіх відомих рас Plasmopara halstedii. Дані лінії використовуються селекціонерами різних країн для створення стійких до НБР генотипів соняшнику, адаптованих для вирощування в певних регіонах. В процесі їх створення селекціонеру потрібно з великих за обсягом гібридних популяцій добирати зразки, в генотипі яких наявним є ген Plarg, про що буде свідчити стійкість зразків до найбільш агресивних рас НБР. Оцінку стійкості зразків соняшника до НБР здійснюють за допомогою методу лабораторної імунологічної діагностики [1]. За даним методом, який ми обрали як прототип нашого способу, насіння соняшника пророщують в термостаті на протязі 2-3 діб, після чого проростки 5-9 см витримують в суспензії зооспор несправжньої борошнистої роси за температури 13-15 °C, потім проростки в рулонах фільтрувального паперу витримують в кліматичних камерах для подальшого пророщування за температури 20-25 °C та вологості повітря 90-95 %. Через 6-7 діб проросткам створюють умови вологої камери на 12-15 годин, після чого по появі на проростках спороношення визначають стійкі та уражені несправжньою борошнистою росою зразки. До недоліків даного способу треба віднести наступні: 1) необхідність підтримки життєздатної популяції патогена, до складу якої повинні входити найбільш агресивні раси; 2) досить тривалий термін проведення оцінки та її коштовність за рахунок використання кліматичних камер в зимовий період, 3) неможливість визначити рівень стійкості на різних стадіях онтогенезу рослини. З метою усунення недоліків способу, що обрано як прототип, пропонується спосіб ідентифікації в генотипах зразків соняшнику гена PlARG, який обумовлює стійкість до несправжньої борошнистої роси, шляхом детекції щільно зчепленого з даним геном ДНКмаркера за використання методу полімеразної ланцюгової реакції. За використання мікросателітних маркерів показана можливість ідентифікації стійких до НБР ліній-носіїв гена PlARG [2]. В основу корисної моделі поставлена задача детекції в генотипах зразків соняшнику маркерних алелів мікросателітного локусу ORS 1039 шляхом аналізу спектрів ДНК, ампліфікованої за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, що дозволить ідентифікацію гена стійкості PlARG. Поставлена задача вирішується тим, що електрофорез в 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації ДНК зразка соняшнику за мікросателітним локусом ORS 1039 та ідентифікації гена стійкості PlARG за наявності в спектрі алеля розміром 190 пар нуклеотидів. Відмінними від прототипу ознаками в корисній моделі, що заявляється, є: - можливість проводити оцінку за використання сегменту будь-якої тканини на будь-якій стадії онтогенезу рослини, - показник, що дозволяє ідентифікувати в генотипі наявність гена стійкості PlARG, - відсутність потреби в наявності інфекційного матеріалу несправжньої борошнистої роси, - точність, надійність та об'єктивність ідентифікації гена стійкості PlARG. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю заявлених ознак та досягнутим результатом (підвищення точності, надійності та об'єктивності ідентифікації гена стійкості) можна пояснити так. Ампліфікація мікросателітного локусу ORS 1039 дозволяє виявляти фрагмент ДНК розміром 190 пар нуклеотидів, який є маркером гена PlARG. При наявності в спектрі ампліфікації ДНК, яка виділена з зразка соняшнику, фрагмента 190 пар нуклеотидів можливо вважати, що в генотипі соняшника ідентифіковано ген стійкості до несправжньої борошнистої роси PlARG. Спосіб здійснюється таким чином. Сегменти тканин соняшника гомогенізують в 1.5 мл-пробірках в лізуючому буфері (20.0 мМ Na3ЕДТА, 0.1 М тріс-НСІ рН 8.5 при 25 °C, 1.4 М NaCl, 2.0 % СТАВ) до повної мацерації тканин. Лізат інкубують 45 хв. при 60 °C. Додають рівний об'єм суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1 за об'ємом), перемішують до утворення білої емульсії. Центрифугують 5 хв. при 14000 об/хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу переносять в чисті пробірки та додають рівний 1 UA 115650 U 5 10 об'єм ізопропілового спирту, перемішують, осаджують ДНК центрифугуванням при 10000 об/хв… протягом 4 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад промивають двічі 0.5 мл 70 % етанола, центрифугують при 10000 об/хв… протягом 5 хв. на мікрофузі "Eppendorf 5415". Осад ДНК підсушують при кімнатній температурі 15 хв. та розчиняють в 0.3 мл ТЕ-буферу (10.0 мМ тріс-НСІ, 1.0 мМ ЕДТА). Після чого проводять полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) на приладі "Терцик" ("ДНК-технологія", Росія). Вміст реакційної суміші для проведення ПЛР об'ємом 20 мкл: 50 мМ КС1, 20 мМ тріс-НСІ (рН 8,4 при 25 °C), 0,01 % Tween-20, 2 мМ MgCl2, 0,2 мкМ кожного праймеру, 200 мкМ кожного dNTP, 10 нг геномної ДНК, 1 одиниця активності ДНК-полімерази Taq. Ампліфікація (35 циклів): денатурація при 94 °C на першому циклі 2 хв., далі - 40 с; відпал при 60 °C 30 с; синтез при 72 °C 2 хв.; остання елонгація 5 хв. В таблиці наведено інформацію про послідовності праймерів для ампліфікації ДНК за локусом ORS1039. Таблиця Праймери для детекції алелів за локусом ORS1039 П З 15 20 25 30 35 40 45 50 Послідовність прямого (П) та зворотного (З) праймерів (5'- 3') СССТТТСАСТТССТАТТТТСТАТТСА CTAAGAGGGGTCGGTATGATTTC Продукти ампліфікації (10 мкл-аліквоту ПЛР-суміші) оцінюють у 10 % поліакриламідному гелі. Склад гелю: 10 % акриламід, 1  ТВЕ-буфер (50 мМ тріс-Н3ВО3, 2 мМ ЕДТА, рН 8.0). Умови електрофорезу: напруга 500 V протягом 120 хв. при 65 °C. Для приготування одного гелю змішують 12.5 мл розчину 30 % поліакриламіду, 2.5 мл 10  ТВЕ-буферу, 25 мкл ТМЕД, 50 мкл 10 % ПСА. Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішують з 1 мкл буфера для нанесення (10 мМ ЕДТА рН 8.0, 0.2 % (w/v) бромфеноловий синій, 0.2 % (w/v) ксиленціанол) та за допомогою шприца вносять в лунку гелю. Одна доріжка гелю повинна містити зразок ДНК з відомою молекулярною масою. Як стандарт молекулярної маси використовують ДНК pUC 19, рестриктовану Mspl. Поліакриламідний гель фарбують відповідно до методики: гель кладуть на 5 хв у 10 % етанол, переносять у 1 % HNO3 на 3 хв., промивають кілька разів дистильованою водою. Витримують 20 хв. у 0.012 М AgNO 3 у темряві, промивають кілька разів дистильованою водою. Інкубують гель у відновлюючому розчині (0.28 М Nа2СО3 (безводний), 0.019 % формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації. Промивають кілька разів бідистильованою водою. Гелі зберігають між двома листами прозорої поліетиленової плівки. Документують отримані електрофореграми за допомогою цифрового фотоапарату. Розмір фрагмента ампліфікації встановлюють за допомогою комп'ютерної програми "Gelanalyzer" згідно стандарту молекулярної маси. За результатами ПЛР-аналізу локуса ORS 1039 встановлюють наявність чи відсутність фрагмента розміром 190 пар нуклеотидів в спектрі ампліфікації ДНК зразка соняшнику, який аналізують. Наявність фрагмента розміром 190 пар нуклеотидів (тобто маркера гена Plarg) свідчить про те, що в даному генотипі соняшника ідентифіковано ген стійкості PlARG. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Ідентифікація гена стійкості PlARG в генотипі інбредної лінії соняшника Одеська 108А. Для дослідження брали насіння інбредної лінії Одеська 108А, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1039. В ДНК-спектрі виявлено фрагмент ампліфікації розміром 205 пар нуклеотидів. Висновок: в генотипі інбредної лінії соняшника Одеська 108А не виявлено маркер гена PlARG, тобто в даній інбредній лінії не ідентифіковано ген стійкості PlARG, що свідчить про відсутність стійкості до несправжньої борошнистої роси. Приклад 2. Ідентифікація гена стійкості PlARG в генотипі лінії соняшника RHA 420. Для дослідження брали насіння лінії RHA 420, виділяли ДНК, проводили електрофорез у 10 % поліакриламідному гелі продуктів ампліфікації за мікросателітним локусом ORS 1039. В ДНК-спектрі виявлено фрагмент ампліфікації розміром 190 пар нуклеотидів. Висновок: в генотипі лінії RHA 420 виявлено маркер гена PlARG, тобто в даній лінії ідентифіковано ген стійкості PlARG, що свідчить про наявність стійкості до несправжньої борошнистої роси. 2 UA 115650 U 5 10 15 Джерела інформації: 1. Долгова Е. М. Экспресс-метод оценки подсолнечника на устойчивость к ложной мучнистой росе / Е.М.Долгова, З.К.Аладьина, В.Н.Михайлова // Селекция и семеноводство. 1990. - Вып. 68. - С. 50-55. 2. Солоденко А.С, Бурлов В.В., Сиволап Ю.М. Маркери гена стійкості соняшника до несправжньої борошнистої роси /А.Є.Солоденко, В.В.Бурлов, Ю.М.Сиволап // Вісник Харківського національного аграрного університету. Серія Біологія. -2014. - Випуск 3 (33). - С 5965. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб ідентифікації гена стійкості PlARG, що включає виявлення стійкого до несправжньої борошнистої роси зразка соняшнику, який відрізняється тим, що здійснюють за допомогою електрофоретичного аналізу продуктів ампліфікації ДНК за мікросателітним локусом ORS 1039 та ідентифікації гена PlARG в генотипі зразка, що аналізують, за наявності в спектрі ампліфікації фрагмента ДНК розміром 190 пар нуклеотидів. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3