Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини

Реферат: Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, включає виділення моноцитів з наступним їх культивуванням у присутності гранулоцит-макрофагального колонієстимулювального фактора для отримання дендритних клітин та стимуляцією їх функціонального дозрівання. Для стимуляції функціонального дозрівання отриманих дендритних клітин використовують екстракт цитоплазматичних мембран S. aureus Wood 46. UA 117502 U (12) UA 117502 U UA 117502 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини та імунології, зокрема до способу стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, які є проміжним продуктом для створення аутологічних протипухлинних вакцин на основі дендритних клітин і можуть бути застосовані в комплексному лікуванні хворих на злоякісні новоутворення. В цій галузі прийнято використовувати такі терміни і скорочення: антигенпрезентуюча здатність представляти чужорідний антиген ефекторним клітинам адаптивного імунітету і таким чином стимулювати специфічну імунну відповідь, аутологічна вакцина - вакцина, матеріалом для якої служать тканини, клітини або молекули вакцинованої особи, лейкомаса - сумарна фракція лейкоцитів периферичної крові, мононуклеарна фракція мононуклеарних лейкоцитів периферичної крові, ГМ-КСФ - гранулоцит-макрофагальний колонієстимулювальний фактор, ФНП - фактор некрозу пухлин, ЛПС - ліпополісахарид, ПГ - пептидоглікан золотавого стафілококу, S. aureus - Staphylococcus aureus - золотавий стафілокок, ЗКЛ - змішана культура лімфоцитів, ЛЦ - лімфоцити, ДНК - дезоксирибонуклеїнова кислота, ФГА - фітогемаглютинін, ЕЦМ - екстракт цитоплазматичних мембран. Відомий спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини ex vivo для створення на їх основі аутологічних протипухлинних вакцин [1]. Спосіб передбачає виділення мононуклеарної фракції з лейкомаси периферичної крові людини методом центрифугування з подальшим їх культивуванням у поживному середовищі в присутності гранулоцит-макрофагального колонієстимулювального фактору (ГМ-КСФ) та інтерлейкіну-4 (ІЛ4) упродовж 6 діб для диференціювання на незрілі ДК та наступної стимуляції функціонального дозрівання утворених незрілих ДК шляхом їх культивування у присутності фактора некрозу пухлин альфа (ФНПа) упродовж 2 діб. Недоліком даного способу є висока сумарна вартість ГМ-КСФ, ІЛ4 та ФНП, що підвищує загальну вартість протипухлинної аутовакцини на основі дендритних клітин і ускладнює широкий доступ пацієнтів з онкологічною патологією до даного протипухлинного імунопрепарату. Існує також спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини для створення на їх основі аутологічних протипухлинних вакцин [2, 3], який включає виділення моноцитів з периферичної крові, культивування виділених клітин у поживному середовищі в присутності ГМ-КСФ упродовж 6 діб для диференціювання на незрілі ДК та наступну стимуляцію функціонального дозрівання утворених ДК шляхом додавання до середовища культивування бактеріального ліпополісахариду (ЛПС). Недоліком вказаного способу є висока токсичність ЛПС, що ускладнює стандартизацію дозування цього препарату у протоколах отримання функціонально зрілих ДК. Найбільш близьким технічним рішенням, вибраним як найближчий аналог, є спосіб стимуляції функціонального дозрівання ДК для створення на їх основі аутологічних протипухлинних вакцин [4], який включає виділення моноцитів з периферичної крові людини, культивування виділених клітин у поживному середовищі з додаванням ГМ-КСФ для диференціювання на незрілі ДК з наступною стимуляцію їх функціонального дозрівання шляхом додавання до середовища культивування бактеріального пептидоглікану (ПГ). Недоліком вказаного способу є обмежений рівень рекрутингу транскрипційного фактору NFB, залученого у експресію мембранних та розчинних маркерів функціональної зрілості ДК, спричинений здатністю ПГ зв'язуватися лише з одним патерн-розпізнавальним рецептором. Обмежений рекрутинг NFB зумовлює низький рівень дозрівання ДК і зниження їх здатності стимулювати протипухлинну імунну відповідь in vivo у складі аутологічних протипухлинних вакцин. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, який забезпечував би максимальну стимуляцію їх антигенпрезентуючої здатності, включав би використання мінімально токсичних реагентів зі стандартизацією їх дозування, що давало б змогу безперешкодно застосовувати його для стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин in vitro і мав би знижену, порівняно з існуючим найближчим аналогом, вартість. 1 UA 117502 U 5 10 15 20 25 30 Поставлена задача вирішена тим, що в способі стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, який включає виділення моноцитів з периферичної крові людини, з наступним їх культивуванням у присутності гранулоцит-макрофагального колонієстимулювального фактора для отримання дендритних клітин та стимуляцією їх функціонального дозрівання, згідно з корисною моделлю, стимуляцію функціонального дозрівання утворених ДК забезпечують шляхом додавання до середовища культивування екстракту цитоплазматичних мембран S.aureus Wood 46 (ЕЦМ). Використання ЕЦМ забезпечує високий рівень стимуляції антигенпрезентуючої здатності утворених ДК завдяки комплексному складу і здатності активувати кілька патернрозпізнавальних рецепторів, має значно нижчу токсичність і вартість. Можливість здійснення корисної моделі ілюструється прикладом, який не обмежує обсяг правової охорони. Приклад конкретного використання У практично здорових донорів стерильно отримували периферичну кров з ліктьової вени в об'ємі 15-20 мл і збирали в пробірку з додаванням 25 МО/мл гепарину («Гедеон-Ріхтер», Угорщина). Отриману кров відстоювали. Лейкоцити сепаративно розділяли у градієнті щільності 3 фіколу (р = 1,077 г/см ), після чого клітини ресуспендували в середовищі RPMI-1640 («Sigma», США) з додаванням 2 мМ/л L-Gly, 100 мкг/мл стрептомиціну та 100 од/мл пеніциліну та інкубували у пластиковому флаконі при температурі 37 С, 5 % СО2 протягом 2-3 годин. Після чого клітини злегка струшували та видаляли ті, що не прикріпилися, шляхом їх змивання. 6 Концентрацію клітин доводили до 0,5  10 /мл середовищем культивування та додавали 1 % аутологічної плазми та 100 нг/мл рекомбінантного гранулоцито-макрофагальноколонієстимулюючого фактора (ГМ-КСФ) людини («Leucomax Novartis», Індія / «ScheringPlaugh», США або «ICN», США), 20 нг/мл інтерлейкіну-4 (IL-4) («Sigma», США). Ростові фактори також додавали до ДК на 3-тю добу культивування. На 7-му добу дозрівання до ДК додавали 100 нг/мл ЛПС («Sigma», США) або ЕЦМ та 2b-IFN («Лаферобіон», «Біофарма», Україна) в концентрації 10 тис. МО/мл. Аналіз функціональних та фенотипових характеристик ДК проводили методом проточної цитофлуориметрії з використанням моноклональних антитіл до маркерів CD83, CD86, CD11c, мічених флюоресцеїну ізотіоціанатом (ФІТЦ), та антитіл до HLA-DR, мічених фікоеритрином («Becton Coulter», США). Показник фагоцитарної активності (ФА) ДК визначали за допомогою проточної цитометрії на основі кількісної оцінки поглинутих ними бактерій S. aureus, мічених ФІТЦ [5]. Таблиця Фенотипові характеристики генерованих in vitro ДК практично здорових людей. Варіанти експерименту Контроль ДК ДК+ЛПС ДК+ЕЦМ (0,2 мкг/мл) ДК+ЕЦМ (0,5 мкг/мл) ДК+ЕЦМ (1 мкг/мл) ДК+ЕЦМ (2 мкг/мл) 57,25±8,19 71,25±6,02 Рівень експресії, % CD86+/ HLAHLA-DR CD83 DR+ 65,5±9,35 56,50±8,26 40,67±76,53 79,00±5,35 70,00±8,35 55,50±7,60° 70,33±8,28 79,50±5,91 76,75±7,65* 84,00±6,10* 76,75±8,91 54,00±11,25 73,00±7,45 66,00±10,45 76,05±9,40 67,40±11,71 46,25±10,29 68,75±9,07 73,25±8,38 80,75±8,14 73,60±9,60 43,00±7,52 70,50±10,00 69,75±7,92 75,00±6,96 71,60±9,89 48,75±8,03 67,50±7,58 CD86 CD11с 35 40 Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, що патентується, забезпечує отримання антигенпрезентуючих клітин з високим рівнем функціональної зрілості завдяки здатності екстракту цитоплазматичних мембран S. aureus Wood 46, використовуваного як стимулятор функціонального дозрівання, активувати кілька патерн-розпізнавальних рецепторів, на відміну від ПГ, який активує лише один рецептор. Застосування ЕЦМ замість ЛПС або ФНП дозволяє здешевити процедуру, оскільки вартість ЕЦМ на 30 % нижча за вартість ЛПС і в 8 разів нижча за вартість ФНП. 2 UA 117502 U Пропонований спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, безпечний для застосування, оскільки використовуваний в ньому препарат ЕЦМ має низьку токсичність, завдяки відсутності домішок ендотоксину і тейхоєвих кислот. 5 10 15 Джерела інформації: 1. Hubo M, Trinschek В, Kryczanowsky F. et al. Costimulatory molecules on immunogenic versus tolerogenic human dendritic cells // Front Immunol. - 2013. - 4:82. doi: 10.3389/fimmu.2013.00082. 2. Храновська Н.М., Гріневич Ю.Я. Метод одержання аутологічної протипухлинної вакцини на основі дендритних клітин (методичні рекомендації), К.: Український центр наукової медичної інформації та патентно-ліцензійної роботи, 2006, - С. 6-7. 3. Dendritic cell protocol /Edited by Stephen P.Robinson and Andrew J.Stagg // Humana Press Inc. - 2001. - 270 p. 4. Опис до патенту України № 51890 U, МПК9 А61В 10/00, G01N 33/48, 2010 (прототип) 5. Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная диагностика // Частные аналитические технологии в клинической лаборатории. М.: Лабинформ-РАМЛД, 1999. - С. 170-177. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 Спосіб стимуляції функціонального дозрівання дендритних клітин, отриманих з моноцитів периферичної крові людини, який включає виділення моноцитів з наступним їх культивуванням у присутності гранулоцит-макрофагального колонієстимулювального фактора для отримання дендритних клітин та стимуляцією їх функціонального дозрівання, який відрізняється тим, що для стимуляції функціонального дозрівання отриманих дендритних клітин використовують екстракт цитоплазматичних мембран S. aureus Wood 46. Комп’ютерна верстка М. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3