Спосіб виготовлення біоматеріалу з кісткової тканини

Реферат: Спосіб включає очищення кістки природного походження та її здрібнювання до необхідних розмірів, обробку кісткових фрагментів здійснюють перекисом водню в перебігу доби та очищеною гарячою водою, періодично змінюючи розчин перекису водню, об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; осмотичну обробку кісткових фрагментів виконують 1 Μ сумішшю із вмістом хлору, наприклад хлориду калію або хлориду літію для рексиса ядер в перебігу до 20 годин та додатково витримують кісткові фрагменти при наднизьких температурах, наприклад до мінус 180 °C у перебігу доби; додатково, значні кісткові фрагменти розміром від 08 мм, очищають за допомогою ультразвуку у ванні із зазначеною вище сумішшю в перебігу до 2 годин при частоті ультразвуку від 20 до 100 кГц, затим у перебігу до 48 годин кісткові фрагменти витримують при низькій температурі до мінус 180 °C в розчині із вмістом фосфатовмісних або сольових розчинів, наприклад 0,2 Μ гідрофосфату натрію, після чого кістковий матеріал промивають протягом певного часу в розчині соляної кислоти для видалення нуклеїнових кислот, після чого кісткові фрагменти промивають дезактиваторами соляної кислоти. UA 118016 U (12) UA 118016 U UA 118016 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до медицини, а саме до технології виготовлення біоматеріалів, які використовують як пластичний матеріал при оперативних заміщеннях кісткових дефектів в ортопедії, травматології та інших галузях відновної хірургії. Відомо, що успіх імплантації залежить не тільки від правильних показань до пересадки і дотримання бездоганної техніки, але й від особливостей самого імплантата, що обумовило необхідність регулювання властивостей імплантата, його якості. Технології створення імплантатів направлені на підвищення їх механічної міцності, підвищення їх остеоіндуктивних властивостей, збільшення терміну збереження кісткової тканини та біоматеріалів, виготовлених з неї, підвищення якості антисептика і зниження антигенних властивостей імплантата. Відомий спосіб одержання біоматеріалу, який полягає в тому, що після очищення кістку природного походження розпилюють на пластини товщиною від 0,2 до 2,0 см, відмивають нагрітим до 65 °C 0,1 Μ фосфатним буфером рН 5,8-6,0, переварюють у розчині активованого 0,1-0,4 % папаїну при 65 °C у перебігу 24 годин, потім пластини промивають п'ятьома об'ємами води при 40-80 °C, обробляють розчином 0,4 N луги при кімнатній температурі протягом 10-24 годин, відмивають проточною водою, знежирюють у сумішах етанол/хлороформ спочатку в співвідношенні 1:2, а потім у співвідношенні 2:1, виконують декальцинацію в 0,4-1 N соляної кислоти, обробляють 1,5-3 % перекисом водню протягом 4 годин, відмивають очищеною водою, потім етанолом, висушують при кімнатній температурі, упаковують і стерилізують [Пат. № 2342162, RU, МПК A61L27/24, A61L27/36, Д61К35/32. Способ получения биоматериалов из костной ткани и полученный этим способом материал для остеопластики и тканевой инженерии /Саващук Д.Α., Панасюк А.Φ. З. № 2007126721/15; заявл. 27.10.2005; опубл. 27.12.2008]. Спосіб дозволяє отримати з'єднання з невеликою кількістю неколагенових білків. Відомий спосіб одержання біоматеріалу, який включає очищення кістки природного походження та її здрібнювання до необхідних розмірів, обробку кісткових фрагментів перекисом водню та сумішшю етанолу із хлороформом, а також стерилізацію та герметизацію, згідно з винаходом, обробку кісткових фрагментів здійснюють 10 % перекисом водню в перебігу доби об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; обробку кісткових фрагментів виконують сумішшю 96 % етанолу із хлороформом в пропорції 1:1 в перебігу 8 годин та додатково витримують кісткові фрагменти при температурі мінус 25 °C у перебігу 20 годин у розчині 0,45 Μ NaCl з об'ємом розчину до об'єму тканин 5:1, затим у перебігу 8 годин кісткові фрагменти витримують при температурі мінус 25 °C в розчині 0,1 Μ Na2HPO4 об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1, після чого кістковий матеріал витримують у розчині цефтриаксону та 0,9 % NaCl з додаванням диметилсульфоксиду та насичують аскорбіновою кислотою [Пат. № 108813, UA, МПК A61K35/32, A61F2/28, Α61Р19/00, А01N1/00, A61L27/00. Спосіб виготовлення біоматеріалу з кісткової тканини /Корж М.О., Вирва О.Є., Воронцов П.М., Хмизов C.O., Сербін М.Є., Тімченко Д.С., Кур'ята О.П., Максименко О.Μ. - З. № а201403313; заявл. 01.04.2014; опубл. 10.06.2015, Бюл. № 11]. Даний спосіб виготовлення біоматеріалу із кісткової тканини є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його вибрано за прототип. В основу винаходу поставлено задачу підвищення якості клінічних та експлуатаційних властивостей біоматеріалу із кісткової тканини шляхом зниження антигенних властивостей кісткової тканини при високому терміні зберігання та покращення технології підготовки імплантата до клінічного використання. Задачу, яку поставлено в основу винаходу, вирішують тим, що у відомому способі виготовлення біоматеріалу із кісткової тканини, який включає попереднє замороження кісткових матеріалів в морозильних камерах при наднизьких температурах, очищення кістки природного походження та її здрібнювання до необхідних розмірів, обробку кісткових фрагментів перекисом водню та сумішшю із вмістом хлору, а також стерилізацію та герметизацію, згідно з винаходом, обробку кісткових фрагментів здійснюють перекисом водню в перебігу доби та очищеною гарячою водою, періодично змінюючи розчин перекису водню, об'ємом розчину до об'єму тканини 5:1 зі зміною розчину 1-2 рази; осмотичну обробку кісткових фрагментів виконують 1 Μ сумішшю із вмістом хлору, наприклад хлориду калію або хлориду літію для рексиса ядер в перебігу до 20 годин та додатково витримують кісткові фрагменті при наднизьких температурах, наприклад до мінус 180 °C у перебігу доби; додатково, значні кісткові фрагменти розміром від 08 мм, очищають за допомогою ультразвуку у ванні із зазначеною вище сумішшю в перебігу до 2 годин при частоті ультразвуку від 20 до 100 кГц, затим у перебігу до 48 годин кісткові фрагменти витримують при низькій температурі до мінус 180 °C в розчині із вмістом фосфатовмісних або сольових розчинів, наприклад 0,2 Μ гідрофосфату натрію, після чого кістковий матеріал промивають протягом певного часу в розчині соляної кислоти для видалення 1 UA 118016 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 нуклеїнових кислот, після чого кісткові фрагменти промивають дезактиваторами соляної кислоти. У разі, коли потрібна декальцинація (демінералізація) кісткового матеріалу, для отримання демінералізованого кісткового матриксу - кісткову масу декальцинують в 10-40 % ЕДТА (Трилон Б), переважно 20-30 % ЕДТА, протягом 2-4 діб, міняючи розчин ЕДТА 1-2 рази на добу, після чого кістковий матеріал або демінералізований кістковий матрикс відмивають в дистильованій або деіонезованій воді. Стабілізація рН відбувається за рахунок витримування кісткових фрагментів в DPBS (фосфатний буфер Дюльбекко) або в іншому фосфатному буфері з фізіологічною pH до 24 годин, після чого кісткову масу дегідратують або ліофілізують. Технічний ефект винаходу досягають за рахунок синергізму сукупності етапів способу, порядку їх виконання та умов, при яких кожен із етапів може бути виконаним. Одержання збереженого за архітектонікою кісткового біоматеріалу та чистого кісткового колагену з низькоантигенними властивостями дозволить використовувати його як матеріал для заміщення кісткових дефектів, а також як носій біологічно активних речовин і клітин. Також спосіб властивий тим, що при очищенні кісткових фрагментів не використовуються ні етанол, ні ацетон, як це було зроблено в прототипі. Спосіб виконують наступним чином. Із детриту після реконструктивно-пластичних операцій, що звичайно піддається утилізації, здійснюють виділення фрагментів кісткової тканини, придатної для переробки в компонент біокомпозиційних препаратів. При цьому процес переробки включає наступні етапи: 1. Кістковий матеріал очищають від м'яких тканин і хряща; 2. Очищений кістковий матеріал заморожують у морозильних камерах при температурному режимі від - 180 °C до -20°C на термін до 60 календарних днів для первинного зниження антигенних властивостей; 3. Далі кістковий матеріал піддають фрагментації шляхом подрібнення (наприклад, розпилювання) на блоки необхідних розмірів; 4. Фрагментований кістковий матеріал промивають дистильованою водою (до +60 °C) від елементів крові і кісткового мозку; 5. Після цього кісткову масу обробляють розчином перекису водню до 24 годин, періодично змінюючи розчин перекису водню. Після обробки розчином перекису водню кісткові фрагменти промивають дистильованою водою кімнатної температури; 7. Далі кістковий матеріал знежирюють в суміші хлоровмісних розчинів (хлороформу з діетиловим ефіром) в співвідношенні 1:1 не менше 12 годин при кімнатній температурі. У разі кісткових блоків, розміром від 08 мм і більше, для екстракції ліпідів і ліпопротеїдів застосовують вищевказану суміш в ультразвуковій ванні (наприклад, при частоті хвилі від 20 до 120 кГц) протягом від 30 до 120 хв. при кімнатній температурі, при цьому не можна використовувати ні етанол, ні ацетон внаслідок згубного вплину на колаген. Після закінчення дії ультразвуку кістковий матеріал відмивають дистильованою водою (не більше і 60 °C) з періодичним провітрюванням від 4 до 20 годин до повного видалення залишків хлоровмісних розчинів. 9. Після знежирення і відмивання кісткову масу піддають осмотичній обробці в сольовому розчині, наприклад хлориду калію, при кімнатній температурі протягом від 12 до 48 годин для рексиса ядер клітин, що залишилися. Після даної обробки - кісткові фрагменти промивають дистильованою водою кімнатної температури. 10. Далі, для більш значного зниження антигенних властивостей неколагенових білків, кістковий матеріал заморожують при температурному режимі до -180 °C в розчині 0,2 Μ гідрофосфату двозаміщеного натрію (концентрація від 1,5 Μ до 3 М). Після даної обробки кісткові фрагменти промивають дистильованою водою кімнатної температури. 11. Далі, кістковий матеріал обробляється протягом певного часу (наприклад, протягом 6 годин) в низькій концентрації кислотного розчині (наприклад, 0,3 нормальної соляної кислоти) при особливому температурному режимі, не більше + 4 °C і не менше + 1 для видалення нуклеїнових кислот. Після даної обробки - кісткові фрагменти промивають стандартними дезактиватори соляної кислоти і дистильованою водою кімнатної температури. 12. У разі, коли потрібна декальцинація (демінералізація) кісткового матеріалу, для отримання демінералізованого кісткового матриксу, кісткову масу декальцинують в 10-40 % розчині ЕДТА (Трилон Б), протягом 2-4 діб, міняючи розчин ЕДТА 1-2 рази на добу. 13. Кістковий матеріал або демінералізований кістковий матрикс відмивають в дистильованій або деіонезованій воді. 14. Стабілізують рН за рахунок витримування кісткових фрагментів в DPBS (фосфатний буфер Дюльбекко) або в іншому фосфатному буфері з фізіологічною рН до 24 годин. 2 UA 118016 U 5 10 15 15. Після цього кісткову масу дегідратують або ліофілізіують. 16. Далі, кісткові біоімплантати упаковуються в спеціальні медичні пакувальні матеріали, маркуються і стерилізуються радіаційним методом дозою до 18 кГр. При обробці кісткового матеріалу використовують наступні засоби, пристрої та матеріали: пінцет хірургічний, кісткоутримувач, бинт ГОСТ 1172-93, вата ТУ У 24.4-31301408-002-2001 ГОСТ 5556-81, марля, ексикатор, кювети, витяжна шафа, бікс, перекис водню ГОСТ 177-88, хлороформ ТУ 6-09-4263-76 чи ВР 2002, натрій хлорид (NaCl), натрій фосфорнокислий двозамісний (Na2HPO4), дистильована вода ГОСТ 6709-72 Маніпуляції виконують при температурі навколишнього середовища (20±5)°С, атмосферному тиску (84,0-106,7) кПа, відносній вологості 30-80 %. Одержаний із кісткової тканини біоматеріал зберігає нативну структуру кісткового колагену та просторову організацію кісткової тканини, що необхідно для її наступної клітинної колонізації, підвищення приживлення за рахунок зниження антигенних характеристик та підвищення тим самим біосумісності і біоінтеграції. Винахід промислово придатний, освоений в лабораторних умовах, результати випробувань доказують практичну цінність одержаного біоматеріалу. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 35 Спосіб виготовлення біоматеріалу із кісткової тканини, який включає очищення кістки природного походження та її здрібнювання до необхідних розмірів, обробку кісткових фрагментів перекисом водню та сумішшю етанолу із хлороформом, а також стерилізацію та герметизацію, який відрізняється тим, що осмотичну обробку кісткових фрагментів виконують 1 Μ сумішшю із вмістом хлору, наприклад хлориду калію або хлориду літію для рексиса ядер в перебігу до 20 годин та додатково витримують кісткові фрагменти при наднизьких температурах, наприклад до мінус 180 °С у перебігу доби; додатково, значні кісткові фрагменти розміром від 08 мм, очищають за допомогою ультразвуку у ванні із зазначеною вище сумішшю в перебігу до 2 годин при частоті ультразвуку від 20 до 100 кГц, затим у перебігу до 48 годин кісткові фрагменти витримують при низькій температурі до мінус 180 °C в розчині із вмістом фосфатовмісних або сольових розчинів, наприклад 0,2 Μ гідрофосфату натрію, після чого кістковий матеріал промивають протягом певного часу в розчині соляної кислоти для видалення нуклеїнових кислот, після чого кісткові фрагменти промивають дезактиваторами соляної кислоти, додатково для декальцинації (демінералізації) кісткового матеріалу, а саме: для отримання демінералізованого кісткового матриксу, кісткову масу декальцинують в 10-40 % ЕДТА (Трилон Б), переважно 20-30 % ЕДТА, протягом 2-4 діб, міняючи розчин ЕДТА 1-2 рази на добу, після чого кістковий матеріал відмивають в дистильованій або деіонезованій воді. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3