Спосіб дослідження ростових якостей води щодо патогенних лептоспір

Реферат: Спосіб дослідження ростових якостей води щодо патогенних лептоспір родини Desmobacteriacea роду Leptospira включає посіви біологічного матеріалу або зразків ґрунту, води, тощо на сироваткові середовища для виділення культури лепто спір. У стерильному боксі 3 проводять посів зразків, в пробірку вносять піпеткою пробу води в об'ємі 8 см , додають сироватку крові овець та антиген (10-14 добову культуру лептоспір з накопиченням 40 і більше 3 3 мікробних клітин у полі зору мікроскопа) у об'ємі, відповідно, 0,4 см та 1 см , засіяні пробірки інкубують у термостаті за температури +28 °C протягом 10-14 діб, як контроль використовують культуру лептоспір: Pomona, Grippotyphosa, Canicola та Icterohaemorrhagiae. UA 118363 U (54) СПОСІБ ДОСЛІДЖЕННЯ РОСТОВИХ ЯКОСТЕЙ ВОДИ ЩОДО ПАТОГЕННИХ ЛЕПТОСПІР UA 118363 U UA 118363 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарної медицини та мікробіології, зокрема до лабораторної діагностики, призначеної для виявлення водойм зі сприйнятливими умовами для розмноження та розвитку збудників лептоспірозу родини Desmobacteriacea роду Leptospira. Спосіб може бути використаним для виявлення потенційних стаціонарно неблагополучних щодо лептоспірозу водойм. Лептоспіроз - це природно-вогнищева інфекція, що вражає, за останніми даними, близько 150 видів ссавців та людину, і реєструється на всіх континентах, крім Антарктиди, у більшості країнах світу [1]. Хворобу ще називають "водною гарячкою", адже люди зазвичай інфікуються у теплу пору року під час купання, риболовлі тощо [2]. Це пояснюється здатністю лептоспір до розмноження і розвитку у водоймах за температури води більше +24 °C та їх здатністю проникати через пошкоджену шкіру (рани, подряпини, порізи та ін.) за рахунок своєї рухливості [3]. Людина сама створює ідеальні умови для проживання основного резервуару цієї інфекції, що пожиттєво виділяє збудник із сечею у навколишнє середовище - гризунів, залишаючи на берегах водойм недоїдки та сміття. Згідно з вимогами чинної настанови з діагностики лептоспірозу, лептоспіри можуть бути визнані збудниками захворювання у тварин та людей лише за підтвердження їхньої етіологічної ролі реакціями мікроаглютинації (РМА) та імуноадсорбції чи бактеріологічним методом [4]. Оскільки постановку РМА та реакції імуноадсорбції виконують лише із пробами сироваток крові від людей та тварин, найближчим аналогом є бактеріологічний спосіб. Цей спосіб включає виділення патогенного мікроорганізму (лептоспіри) з живих або мертвих тканин макроорганізму (хворих тварин, органів із трупів, абортованих плодів) та об'єктів зовнішнього середовища (води, ґрунту тощо). Суть способу полягає у висівах біологічного матеріалу (крові, ліквору, сечі та гомогенізованої суспензії з патологічного матеріалу) або зразків ґрунту, води тощо на сироваткові середовища Терських, Кортгофа, Тарасова та на безсироваткові EMJH, твін (полісорбат)-альбумінові середовища з метою виділення культури лептоспір. 3 Висіви зразків води рекомендується проводити одразу після її відбору в кількості 1,0 см в 33 5 пробірках на кожну пробу з додаванням 0,5 см сироватки крові від овець (поживне середовище для лептоспір). Більша за вказану кількість води інгібує ріст та розмноження лептоспір за умови їхньої наявності у зразках. Температура, за якої культивують ізоляти, - +28+30 С, рН середовища - 7,2-7,4. Хоча всі операції зі зразками проводять, дотримуючись умов стерильності, для отримання чистої культури в середовище культивування додають такі препарати як 5-FU (100 мг/л), солі 3 3 3 сульфатіазолу (50 мг/см ), неоміцину сульфат (5 мг/см ), актидіон (циклогексамід) (0,5 мг/см ) з метою пригнічення росту сторонньої мікрофлори. Мікроскопію висівів для визначення наявності росту лептоспір проводять під мікроскопом з конденсором "темного поля" за збільшення 20×10×1,5 на 7-у, 10-у, 14-у добу і далі через кожні 6-8 діб культивування. Ізолювання лептоспір з патологічного матеріалу дає підставу вважати діагноз на лептоспіроз встановленим. Подальше вивчення виділеної культури лептоспір проводиться з урахуванням її біологічних, серологічних та інших властивостей [3, 5]. Хоча бактеріологічний спосіб є одним з найбільш точних діагностичних засобів, він має ряд суттєвих недоліків, до яких відносять наступні: 1. Значні витрати часу на культивування лептоспір (не менше 8-10 тижнів), а окремі автори наголошують, що ріст ізолятів лептоспір може затримуватись на 1,5-3 місяці. Зустрічаються повідомлення, що виділення лептоспір з патологічного матеріалу може тривати до 6 місяців. 2. Не гарантована можливість виділення збудника. Об'єктивними причинами того, що лептоспіри не виділяються з досліджуваного матеріалу є недостатня кількість клітин збудника в зразку. 3. Проведення великого об'єму рутинної лабораторної роботи для збільшення можливості виділення ізоляту. 4. Труднощі, що пов'язані з отриманням чистої культури, адже у зразках наявна стороння мікрофлора, що інгібує ріст лептоспір. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виявлення стаціонарно неблагополучних водойм, що потенційно можуть слугувати резервуарами лептоспірозної інфекції, який усував би перераховані недоліки аналога і мав нові якісні показники. Створити новий спосіб дослідження води із водойм на перевірку ростових якостей щодо патогенних лептоспір L. interrogans. 1 UA 118363 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Технічний результат корисної моделі полягає в усуненні перерахованих недоліків аналогу (бактеріологічного методу) і володіння новими якісними показниками, а саме: зменшення затрат часу на проведення дослідження, відсутність потреби у приготуванні живильних середовищ для лептоспір, спрощення постановки реакції, точна і об'єктивна інтерпретація отриманих результатів реакції. Поставлена задача вирішується тим, що у способі дослідження ростових якостей води щодо патогенних лептоспір родини Desmobacteriacea роду Leptospira, який включає посіви біологічного матеріалу або зразків ґрунту, води, тощо на сироваткові середовища для виділення культури лептоспір, згідно з корисною моделлю, у стерильному боксі проводять посів зразків, в 3 пробірку вносять піпеткою пробу води в об'ємі 8 см , додають сироватку крові овець та антиген (10-14 добову культуру лептоспір з накопиченням 40 і більше мікробних клітин у полі зору 3 3 мікроскопа) у об'ємі, відповідно, 0,4 см та 1 см , засіяні пробірки інкубують у термостаті за температури +28 °C протягом 10-14 діб, як контроль використовують культуру лептоспір: Pomona, Grippotyphosa, Canicola та Icterohaemorrhagiae. Експериментально доведено, що на життєдіяльність мікроорганізмів роду Leptospira у водоймах впливає дуже багато фізико-хімічних факторів, основні з яких - хімічний склад води, рН, температура, осмотичний тиск, характер рослинності на берегах (наприклад, екстракт з листя верби SalixL. пригнічує ріст лептоспір), мікроорганізми інших родин тощо [6]. Матеріалом для проведення перевірки ростових якостей є: 1) серогрупи патогенних лептоспір, що є гостальними для людей і тварин; 2) проби води, відібрані із досліджуваних на ростові якості патогенних лептоспір водойм. Для досліджень використовуються наступні серогрупи лептоспір: Pomona (серовар ротопа), Grippotyphosa (серовар grippotyphosa), Canicola (серовар canicola) та Icterohaemorrhagiae (серовар copenhageni). Відбір проб води проводиться з водойм (ставків, озер, тощо) влітку за температури води 3 +23…+25 °C при ясній погоді. Проби води відбираються в об'ємі 200 см з трьох різних місць водойми у стерильний посуд з метою запобігання потрапляння сторонньої мікрофлори. Проби маркуються. Кожен зразок розсівається на 3 пробірки. Проведення дослідження складається із наступних етапів: 1. У стерильному боксі проводиться посів зразків. В пробірку вносимо піпеткою пробу води в 3 об'ємі 8 см . 2. Додаємо до засіяних пробірок сироватку крові овець та антиген (10-14 добову культуру лептоспір з накопиченням 40 і більше мікробних клітин у полі зору мікроскопа) у об'ємах, 3 3 відповідно, 0,4 см та 1 см . 3. Засіяні пробірки інкубуються у термостаті за температури +28 °C протягом 10-14 діб. Як контроль використовується 10-14 добова культура лептоспір серогруп: Ротопа (серовар ротопа), Grippotyphosa (серовар grippotyphosa), Canicola (серовар canicola) та Icterohaemorrhagiae (серовар copenhageni), вирощена на живильних середовищах (Терських, Кортгофа тощо) за температури - +28-+30 С і рН середовища - 7,2-7,4. Облік реакції здійснюється за мікроскопії з конденсором "темного поля" за збільшення 20×10×1,5 на 10-14 добу культивування. Результати порівнюються з накопиченням культури лептоспір у контролях. Інтерпретація результатів. Вода вважається придатною для розмноження та розвитку лептоспір за накопичення мікробних клітин в одній і більше пробах з однієї водойми 40 і вище 3 (40 млн. в 1 см ), що відповідає показнику у контролі. Розроблений спосіб має суттєві переваги над аналогом, а саме: 1) зменшення затрат часу на проведення дослідження (облік проводимо через 10-14 діб), тоді як за бактеріологічного методу, що є аналогом - не менше 8-10 тижнів; 2) спосіб проведення дослідження не є трудомістким (відсутня потреба рутинної лабораторної роботи для збільшення можливості виділення ізоляту); 3) об'єктивність отриманих результатів (за аналогу не гарантована можливість виділення збудника через недостатню кількість лептоспір у зразку); Спосіб знайде застосування у виробничих лабораторіях ветеринарної медицини та науководослідних установах, а також у господарствах за проведення оздоровчих заходів щодо лептоспірозу тварин. Джерела інформації: 1. Sykes J.Ε. 2010 ACVІM Small Animal Consensus Statement on Leptospirosis: Diagnosis, Epidemiology, Treatment and Prevention /J.E. Sykes, K. Hartmann, K.F. Lunn [et al.] //Journal of Veterinary Internal Medicine. - 2011. - Vol. 25(1). - P. 1-13. 2 UA 118363 U 5 10 2. Narita M. Leptospirosis after recreational exposure to water in the Yaeyama islands, Japan /M. Narita [et al.] //The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. - 2005. - Vol. 73(4). - P. 652656. 3. Малахов Ю.А. Лептоспироз животных / Ю.А. Малахов, А.Н. Панин, Г.Л. Соболева. Ярославль: ДИА-пресс, 2001. - 548 с. 4. Настанова з лабораторної діагностики лептоспірозу. - К., 1996. - 25 с. 5. Недосєков В.В. Лептоспіроз сільськогосподарських тварин /В.В. Недосєков, В.В. Уховський, О.О. Кучерявенко. - К.: НуБіП, 2011. - 139 с. 6. Гулай О.В. Консортивні зв'язки спірохет Leptospira interrogans у прибережно-водних екосистемах: автореф. дис. на здоб. вчен. ступ. канд. біол. наук: спец. 03.00.16 "Екологія" / О.В. Гулай. - К., 2005. - 24 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб дослідження ростових якостей води щодо патогенних лептоспір родини Desmobacteriacea роду Leptospira, який включає посіви біологічного матеріалу або зразків ґрунту, води, тощо на сироваткові середовища для виділення культури лептоспір, який відрізняється тим, що у стерильному боксі проводять посів зразків, в пробірку вносять 3 піпеткою пробу води в об'ємі 8 см , додають сироватку крові овець та антиген (10-14 добову культуру лептоспір з накопиченням 40 і більше мікробних клітин у полі зору мікроскопа) у об'ємі, 3 3 відповідно, 0,4 см та 1 см , засіяні пробірки інкубують у термостаті за температури +28 °C протягом 10-14 діб, як контроль використовують культуру лептоспір: Pomona, Grippotyphosa, Canicola та Icterohaemorrhagiae. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3