Застосування наночастинок золота або срібла як агентів елімінації плазмід антибіотикорезистентності

Реферат: Застосування наночастинок золота або срібла. Наночастинок використовують як агенти елімінації плазмід антибіотикорезистентності. золота або срібла UA 118364 U (12) UA 118364 U UA 118364 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, медицини та ветеринарії. Відомо, що в бактеріальних популяціях розповсюджені екстрахромосомні фактори спадковості - плазміди, які несуть гени антибіотикорезистентності (R-плазміди), гени деградації хімічних речовин тощо [Пехов А.П. Основы плазмидологии. 1996 г.]. Оскільки явище стійкості до антибіотиків являє загрозу для здоров'я людини та тварин, пошук засобів деструкції R-плазмід та їх незворотної елімінації із бактеріальної клітини є надзвичайно актуальним завданням. Автори вивчили характер взаємодії R-плазмід (на прикладі рекомбінантних плазмід pUC19 та pBR322) з наночастинками золота і срібла та вперше запропонували застосовувати такі частинки як агенти елімінації плазмід антибіотикорезистентності. У наведених нижче прикладах здійснення корисної моделі надані переконливі свідчення щодо ефективності застосування наночастинок золота й срібла для зміни структури R-плазмід та їх елімінації із бактеріальних клітин. Приклад 1. Вплив наночастинок золота або срібла на структуру R-плазмід Використовували стерильні водні препарати наночастинок золота або срібла розміром 30 нм у вихідних концентраціях відповідно 19,2 та 86,0 мкг/мл за металом. Як об'єкти досліджень застосовували рекомбінантні плазміди pUC19 та pBR322, які використовуються для клонування та мають гени антибіотикорезистентності. Плазміда pUC19 містить 2686 нуклеотидних пар, висококопійна, несе ген, що забезпечує стійкість до антибіотика r ампіциліну Amp , (GenBank Assession Number LO9137). Плазміда pBR322 містить 4361 r r нуклеотидну пару, висококопійна, несе гени ампіцилінової Amp та тетрациклінової Tet резистентності, (Genbank Assession Number J01749). Плазміди pUC19 та pBR322 знаходилися в бактеріях E.coli XL 1-Blue Kan (Stratagene). Препарати плазмід одержували методом лужного лізису за Бірнбоймом і Долі [Birnboim H.C., Doly J. Nucleic Acids Res. - 1979. - 7. - № 6. - P. 1513-1523] та розчиняли в стерильній дистильованій воді і зберігали при -20 °C. Препарати плазмід, розведені стерильною дистильованою водою, змішували зі стерильним водним препаратом наночастинок металу та проводили інкубацію при 24 °C протягом 30-60 хвилин. Концентрація наночастинок в інкубаційних сумішах складала: золота - 9,6 за металом, а срібла 43,0 мкг/мл за металом. Після завершення процесу інкубації одержували препарати плазмідної ДНК з наночастинками відповідного металу та здійснювали їх електронно-мікроскопічний аналіз за допомогою трансмісійного електронного мікроскопу JEOL JEM-1230 Electron Microscope ("Tokyo Boeki Ltd", Японія). Для порівняння готували та аналізували також контрольні препарати наночастинок металів та контрольні препарати нативних плазмід. На фіг. 1 представлені одержані електронно-мікроскопічні зображення взаємодії наночастинок золота з плазмідою pUC19 (А) та зображення взаємодії наночастинок срібла з плазмідою pUC19 (В), а також зображення контролю - препарату нативної плазміди pUC19 (С). На фіг. 2 наведено електронно-мікроскопічні зображення результатів взаємодії наночастинок золота (А) та срібла (В) з плазмідою pBR322, а також зображення контролю препарату нативної плазміди pBR322 (C). Аналіз наведених електронно-мікроскопічних зображень свідчить про наявність структурних змін в обох плазмідах під дією наночастинок як золота так і срібла. Якщо на зображеннях контрольних препаратів плазміди мають структуру у формі глобул, то після інкубації з наночастинками препарати містять релаксовані форми плазмід у вигляді "розплетених" ниток з розміщеними на них наночастинками металів, причому наночастинки срібла розміщуються на нитках плазміди pUC19 з певною періодичністю. Наведені експериментальні дані є доказом наявності безпосередньої дії наночастинок золота і срібла на структуру R-плазмід, яка призводить до їх релаксації. Приклад 2. Елімінація плазмід pUC19 та pBR322 з клітин бактерій Е.соlі XL 1-Blue Kan (Stratagene) Елімінацію плазмід pUC19 та pBR322 з клітин плазмідовмісних бактерій Е.соlі здійснювали: шляхом спонтанної елімінації та шляхом обробки плазмідовмісних бактерій наночастинками золота та срібла з послідуючою контрселекцією. Рівень спонтанної елімінації оцінювали при культивуванні плазмідовмісних бактерій Е. соlі XL 1-Blue (pUC19) та Е.соlі XL 1-Blue (pBR322) на середовищі МПБ без антибіотика протягом 18 годин. В тих же умовах культивування проводили обробку бактерій Е. соlі XL 1-Blue (pUC19) та Е. соlі XL 1-Blue (pBR322) препаратами наночастинок золота або срібла. 1 UA 118364 U 5 10 Використовували препарати наночастинок золота розміром 20 нм в концентрації (за металом) 5,8 мкг/мл та розміром 30 нм - в концентрації 30 нм - 9,6 мкг/мл, а також препарати наночастинок срібла розміром 30 нм в концентрації 17,0 мкг/мл за металом. Одержані результати оцінки частоти елімінації плазмід з плазмідовмісних штамів бактерій Е. соlі XL 1-Blue у вищевказаних умовах наведено в таблиці. Представлені у таблиці дані свідчать про високу частоту елімінації R-плазмід під дією наночастинок золота та срібла, яка значно перевищує рівень спонтанної елімінації. Наведені у прикладах 1, 2 експериментальні дані підтверджують здатність наночастинок золота та срібла змінювати структуру плазмід шляхом релаксації та викликати високу частоту елімінації плазмід pUC19 та pBR322 із бактерій штамів E. coli XL 1-Blue (pUC19) та E. coli XL 1Blue (pBR322). Таким чином, можливість та ефективність застосування наночастинок золота і срібла як агентів елімінації R-плазмід є доведеною. Таблиця Тип елімінації плазмід Плазмідовмісний штам Е.соlі XL 1-Blue (pUC 19) Е.соlі XL l-Blue (pBR322) Елімінація наночастинками Е.соlі XL 1-Blue (pUC 19) золота 20 нм E.coli XL 1-Blue (pBR322) Елімінація наночастинками E.coli XL 1-Blue (pUC19) золота 30 нм Е.соlі XL 1-Blue (pBR322) Елімінація наночастинками E.coli XL 1-Blue (pUC19) срібла 30 нм Е.соlі XL 1-Blue (pBR322) Спонтанна елімінація Частота елімінації (%) 37 34 89 86 91 90 98 96 15 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Застосування наночастинок антибіотикорезистентності. золота або срібла 2 як агентів елімінації плазмід UA 118364 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3