Спосіб оцінки функціонального стану мітохондрій

Реферат: Спосіб оцінки функціонального стану мітохондрій, за яким цілісні клітини інкубують із субстратом окиснення, після чого додають полярографічну комірку, реєструють базальне споживання кисню, після чого додають протонофор FCCP та реєструють протонофорстимульоване дихання, процедуру повторюють з підвищеними концентраціями FCCP до досягнення максимального стимулюючого ефекту і за записом споживання кисню розраховують максимальну швидкість протонофорстимульованого дихання, оптимальну концентрацію протонофора. Додатково розраховують сповільнення споживання кисню за рівнянням поліному другого порядку: 1      0    0 t  at2  , . 2   UA 118816 U (54) СПОСІБ ОЦІНКИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ МІТОХОНДРІЙ UA 118816 U UA 118816 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до галузі біології, а саме клітинної фізіології, та може бути використана для дослідження процесів мітохондріального окиснення у цілісних клітинах різного типу в умовах in situ. Відомий спосіб оцінки функціонального стану мітохондрій, за яким досліджують максимальну окисну здатність за використання протонофора FCCP (карбонілціанід-4(трифлуорметокси)-фенілгідразону), що спричиняє деполяризацію мембрани мітохондрій і максимально активує компенсаторну реакцію дихального ланцюга, яку можна виміряти за споживанням кисню (Brand M.D., Nicholls D.G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells // Biochem. J. - 2011. - Vol. 435. - P. 297-312). У способі не враховують залежності максимальної окисної здатності мітохондрій від концентрації і тривалості дії протонофора. Найближчим за технічною суттю прототипом є спосіб дослідження резервної дихальної здатності мітохондрій нервових закінчень (Choi S.W. et al. Bioenergetics analysis of isolated cerebrocortical nerves terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure // J. Neurochem. - 2009. - Vol. 109. - P. 1179-1191), за яким після реєстрації базальної швидкості мітохондріального дихання клітин почергово, у порядку зростання концентрацій, додають протонофор FCCP. За найбільшим значенням швидкості дихання характеризують максимальну окисну здатність мітохондрій досліджуваних клітин. Проте, спосіб не враховує динаміки зниження швидкості FCCP-стимульованого дихання, яке спостерігається у другій фазі дії протонофора - після досягнення максимальної швидкості дихання, що є основним недоліком прототипу. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб оцінки функціонального стану мітохондрій шляхом використання рівняння поліному другого порядку для розрахунку сповільнення споживання кисню FCCP-стимульованого дихання клітин, що дасть змогу описати динаміку вмісту кисню у середовищі. Поставлена задача вирішується так, що у способі оцінки функціонального стану мітохондрій цілісні клітини інкубують із субстратом окиснення, додають у полярографічну комірку, реєструють базальне споживання кисню, після чого додають протонофор FCCP та реєструють протонофорстимульоване дихання, процедуру повторюють, вносячи FCCP у вищих концентраціях кілька разів до досягнення максимального стимулюючого ефекту. За записом споживання кисню розраховують максимальну швидкість протонофорстимульованого дихання, оптимальну концентрацію протонофора, причому додатково розраховують сповільнення споживання кисню за рівнянням поліному другого порядку, що описує динаміку вмісту кисню у середовищі під час другої фази протонофорстимульованого дихання. Оптимальну концентрацію FCCP встановлюють як середньоарифметичне значення концентрацій, за яких і спостерігають максимальний ефект. Сповільнення споживання кисню у другу фазу FCCP-стимульованого дихання розраховують за рівнянням поліному другого порядку: 1      0    0 t  at 2 , 2   (1) 40 де N - вміст O2 у розчині в момент часу t (нмоль), N0 - початковий вміст О2 у розчині (нмоль), t - час (хв.), ν0 - швидкість споживання кисню (нмоль О2/млн клітин / хв.), а - прискорення 2 споживання кисню (нмоль О2/млн. клітин /хв. ). Рівняння (1) використовують для розрахунку прискорення споживання кисню як другу похідну по часу: a 45 50 55 d , dt (2) Оскільки швидкість дихання знижується з часом спостерігається рівносповільнена зміна вмісту О2 у розчині, значення а є від'ємним і характеризує сповільнення FCCP-стимульованого дихання клітин. Чим ближче значення а до нуля, тим стійкішими є мітохондрії до навантажень протонофором. Цей параметр можна використовувати для характеристики стійкості процесів мітохондріального дихання. Автори корисної моделі вперше запропонували використовувати рівняння поліному другого порядку у дослідженнях максимальної окисної здатності мітохондрій цілісних клітин. Це дало змогу оцінити стійкість мітохондрій у цілісних клітинах до високих навантажень. Фіг. 1. Споживання кисню ацинарними клітинами підшлункової залози за окиснення екзогенних малату, глюкози та пірувату. Фіг. 2. Сповільнення максимальної швидкості дихання ацинарних панкреатитів в залежності від субстрату окиснення за умов окиснення субстратів: 1 - глутамін, 2 - диметил-а-кетоглутарат, 1 UA 118816 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 3 - піруват, 4 - глюкоза, 5 - монометилсукцинат, 6 - ізоцитрат, 7 - малат; □ - 0,5 мкмоль/л FCCP, - 1,5 ммоль/л FCCP. Запропонований спосіб здійснюється так. Дослідження проводять на суспензії ізольованих клітин, наприклад підшлункової залози щурів, яку отримують за способом Вільямса (Williams J.A., Korc M., Dormer R.L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini // Am. J. Physiol. 1978. - Vol. 235, № 5. - P. 517-524). Ацинуси ізолюють у середовищі виділення, що має такий склад, ммоль/л: NaCl-140,0, КС1-4,7, СаСl2-1,3, MgCl2-1,0, HEPES-10,0, глюкоза - 10,0, піруват 2, глутамін - 2, амінокислоти модифікованого середовища Ігла (MEM); pH 7,4. Середовище містить також бичачий сироватковий альбумін (2,5 мг/мл) та соєвий інгібітор трипсину (0,1 мг/мл). Для перевірки цілісності плазматичних мембран клітини фарбують у 0,1 %-му розчині трипанового синього. Підрахунок клітин здійснюють за допомогою камери Горяєва. Коли кількість незабарвлених клітин становить 95 % і більше, проводять подальше дослідження. Швидкість споживання кисню визначають полярографічно за допомогою закритого електрода Кларка. Температура інкубації становить 37 °C. Як субстрат окиснення використовують одну з цих речовин: піруват, глутамат, глутамін, піруват, сукцинат, монометилсукцинат, а-кетоглутарат, диметил-а-кетоглутарат, малат, ізоцитрат, глюкоза. Клітини преінкубують із субстратом окиснення 15 хв., після чого дихання ізольованих клітин стимулюють протонофором FCCP у концентраціях 0,5-2 мкмоль/л. За отриманими даними визначають максимальну окисну здатність мітохондрій у кожному експерименті як відношення максимальної швидкості FCCP-стимульованого дихання до швидкості базального дихання і розраховують її середньоарифметичне значення незалежно від концентрації FCCP. Усі статистичні та математичні розрахунки проводять за допомогою комп'ютера з використанням пакету програм Microsoft Office Excel. Спосіб можна продемонструвати на такому прикладі. За внесення FCCP у концентраціях 0,5 чи 1,5 мкмоль/л швидкість дихання спочатку знаходиться на максимальному рівні упродовж 2-3 хв. початкового відрізку часу, а потім поступово спадає. За окиснення різних субстратів сповільнення дихання у другу фазу FCCPстимульованого дихання сильно відрізняється (Фіг. 1), що свідчить про різну здатність субстратів тривалий час підтримувати мітохондрії у стані інтенсивного окиснення за високих навантажень. Максимальні окисні здатності мітохондрій залежать від субстрату окиснення і становлять 2,28±0,45, 2,13±0,31, 2,04±0,20, 1,89±0,28, 1,73±0,15, 1,70±0,20 чи 1,68±0,31 в.о. за наявності глутаміну, диметил-α-кетоглутарату, монометилсукцинату, малату, пірувату, глюкози чи ізоцитрату відповідно. Встановлено, що сповільнення у другу фазу протонофорстимульованого дихання не залежить від максимальної окисної здатності і в більшості випадків суттєво зростає внаслідок підвищення концентрації FCCP з 0,5 до 1,5 мкмоль/л (Фіг. 2). Сповільнення FCCPстимульованого дихання відрізняється для різних субстратів у порядку зростання: глутамін, диметил-α-кетоглутарат, піруват, глюкоза, монометилсукцинат, ізоцитрат, малат. Глутамін, диметил-α-кетоглутарат і піруват здатні найбільш стабільно підтримувати мітохондріальне дихання за максимального навантаження протонофором. Визначення сповільнення споживання кисню дає змогу більш точно та комплексно оцінити функції мітохондрій у живих клітинах. Запропонований спосіб дає змогу оцінити функціональний стан мітохондрій у цілісних клітинах за параметрами протонофорстимульованого дихання, що підтверджує передбачуваний технічний результат. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 50 55 Спосіб оцінки функціонального стану мітохондрій, за яким цілісні клітини інкубують із субстратом окиснення, після чого додають полярографічну комірку, реєструють базальне споживання кисню, після чого додають протонофор FCCP та реєструють протонофорстимульоване дихання, процедуру повторюють з підвищеними концентраціями FCCP до досягнення максимального стимулюючого ефекту і за записом споживання кисню розраховують максимальну швидкість протонофорстимульованого дихання, оптимальну концентрацію протонофора, який відрізняється тим, що додатково розраховують сповільнення споживання кисню за рівнянням поліному другого порядку: 1      0    0 t  at 2  , 2   2 UA 118816 U де N - вміст O2 у розчині в момент часу t (нмоль), N0 - початковий вміст О2 у розчині (нмоль), t час (хв.), 0 - швидкість споживання кисню (нмоль О2/млн. клітин/хв.), а - прискорення 2 споживання кисню (нмоль О2/млн. клітин/хв. ). Комп’ютерна верстка О. Гергіль Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3