Спосіб діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок

Реферат: Спосіб діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок включає проведення мікроскопічного дослідження біологічного матеріалу з гнійної рани та подальший його морфометричний аналіз. Визначають загальну кількість та інтенсивність цитоплазматичної експресії CD68 при імуногістохімічному дослідженні макрофагів. UA 119601 U (12) UA 119601 U UA 119601 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до клінічної діагностики, та може бути використана для діагностики перебігу ранового процесу у гнійній рані та трофічній виразці при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок. Як прототип вибраний спосіб діагностики перебігу ранового процесу [Патент 111435 Україна, МПК (2016.01) А61В 5/00, G01N 33/48 (2006.01). Спосіб діагностики перебігу ранового процесу / Бурковський М.І., Петрушенко В.В., Желіба М.Д., Чорнопищук P.M.; патентовласник Вінницький національний медичний університет ім. М.І.Пирогова. - № а 2015 00797; заявл. 27.07.2015; опубл. 25.04.2016, Бюл. № 8], який включає проведення мікроскопічного дослідження біологічного матеріалу з гнійної рани та подальший його морфометричний аналіз з визначенням фактора форми нейтрофільних гранулоцитів. Ознаками, які співпадають з істотними ознаками моделі, що заявляється, є: проведення мікроскопічного дослідження біологічного матеріалу з гнійної рани та подальший його морфометричий аналіз. Технічним результатом корисної моделі є: підвищення технологічності, інформативності та точності діагностики перебігу ранового процесу гнійної рани та трофічної виразки при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок. Причинами, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату, є: недостатній рівень технологічності, пов'язаний з багатоетапністю діагностики перебігу ранового процесу гнійної рани з використанням світлової мікроскопії і подальшим комп'ютерним аналізом отриманих морфометричних даних, та недостатній рівень інформативності та точності, пов'язаний з дослідженням закономірностей змін нейтрофільних гранулоцитів. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити відомий спосіб, в якому шляхом зміни технології діагностики перебігу ранового процесу досягають підвищення рівня технологічності, а отже і діагностичної інформативності та точності. Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок, який включає проведення мікроскопічного дослідження біологічного матеріалу з гнійної рани та подальший його морфометричний аналіз, згідно з корисною моделлю, визначають загальну кількість та інтенсивність цитоплазматичної експресії CD68 при імуногістохімічному дослідженні макрофагів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом простежується наступний: визначення інтенсивності цитоплазматичної експресії CD68 при імуногістохімічному дослідженні макрофагів сприяє підвищенню технологічності, інформативності та точності діагностики перебігу ранового процесу. Адже принциповою особливістю трофічних виразок на відміну від більшості ран є відсутність чіткої стадійності ранового процесу та виражене пригнічення репаративних процесів тканин. При цьому в межах одного виразкового дефекту можуть одночасно визначатись ознаки, які відповідають усім трьом фазам ранового процесу. Проте, найважливішим клітинним компонентом в патогенезі загоєння ран є макрофаги, які в залежності від функціональної активності продукують різні біологічно активні речовини, ініціюють і модулюють імунні реакції, забезпечують антимікробний захист і фагоцитоз, регулюють проліферативну активність інших клітинних типів. Спосіб діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок полягає у наступному. Забір матеріалу для дослідження проводять методом пункційної біопсії з краю трофічної виразки, пробійником діаметром 4 mm (Biopsy Punch 4,0 mm) з використанням інфільтраційної анестезії 2 % розчином лідокаїну. Матеріал біоптатів шкіри хворих розмірами 0,4см  0,4см  0,5см фіксують у 10 % нейтральному формаліні. Мінімальний термін фіксації становить 10 днів, протягом яких фіксуючу рідину змінюють двічі. Фіксатор відмивають у проточній водопровідній воді 24 години. Тканини зневоднюють в батареї спиртів висхідної концентрації (50 %, 60 %. 70 %, 80 %, 96 % - 1, 96 % - 2 і абсолютний спирт), просвітлюють у ксилолі, витримують у насиченому при + 37 °C розчині парафіну в ксилолі, занурюють у парафін при + 56 °C, з подальшою заливкою в суміш парафіну та бджолиного воску та виготовленням парафінових блоків. З парафінових блоків готують серійні зрізи товщиною 5 мкм на адгезивних скельцях, покритих полізином ("Menzel-Glaser", Німеччина). Імуногістохімічне дослідження шкіри проводять за допомогою реактивів компанії DAKO з моноклональними антитілами CD68 (Clone PG-M1, розведення 1: 50) на автостейнері DAKO за стандартизованою методикою. Моноклональне антитіло CD68 є гомологом мишиного макросіаліну - протеїну, що локалізується в мембранах лізосом. Система візуалізації EnVision ™ FLEX +, Mouse, High pH (Link), Code K8012 на автостейнері фірми DAKO. Морфометричне дослідження включає підрахунок позитивних клітин в 3 полях зору при збільшенні 200. Інтенсивність цитоплазматичної експресії CD68 оцінюють напівкількісним 1 UA 119601 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 методом на підставі виразності забарвлення та кількості гранул в цитоплазмі за наступною схемою: слабка експресія і виражена. Морфометричне дослідження включає підрахунок клітин за допомогою програми Software DP-SOFT. Відомості, що підтверджують застосування способу. Запропонований спосіб діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок застосували при морфологічному дослідженні біоптатів шкіри нижніх кінцівок, взятих по краю трофічної виразки у 12 хворих з трофічними виразками при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок (ХВН). Дослідження проведено у двох групах, по 6 хворих у кожній. За демографічними показниками між двома групами пацієнтів статистичні відмінності були відсутні. В обох групах переважали жінки. Також досліджувані групи хворих були співставні за наявності у пацієнтів супутніх захворювань. В обох групах для місцевого лікування застосовували багатокомпонентні антибактеріальні водорозчинні мазі, які доповнювали компресійної терапією та призначенням флеботонізуючих препаратів. У хворих другої групи додатково у комплексному лікуванні трофічних виразок застосовували репарант і ентеросорбцію (Патенти України № 89297 та № 112033). Діагностику перебігу ранового процесу у трофічних виразках при хронічній венозній недостатності нижніх кінцівок за запропонованим способом здійснювали при поступленні та на 7-у і 14-у добу від початку комплексного лікування. В якості контролю досліджували здорову шкіру померлих пацієнтів, без судинної патології і виразкових дефектів нижніх кінцівок (n=5). Аналіз позитивної реакції CD68 клітин дозволив виділити різні генерації макрофагів (МФ), поліморфних за формою, розмірами та інтенсивністю реакції. Дрібні витягнуті МФ зі слабкою візуалізацією коричневих гранул, що розсіяно заповнюють цитоплазму клітини, мають слабку експресію маркера та низьку функціональну активність. Великі округлі або овальні МФ з наявністю паростків і виразною пилоподібною зернистістю, дифузно розташованих в цитоплазмі клітин, розцінені як висока експресія та високо функціональні. Кількісні показники позитивних CD68 МФ у запальному інфільтраті трофічних виразок при ХВН під час проведення комплексного лікування у двох досліджуваних групах хворих представлені у таблиці. Загальна кількість СD68-позитивних МФ склала в середньому 74,07±5,19 у групі хворих з ХВН, що є достовірно відмінним по відношенню до контролю (10,14±0,79). Слід зазначити, що найбільш інтенсивна експресія CD68 в МФ визначається тільки в 9,60±0,64 клітин у групі хворих з ХВН, що практично в двічі перевищує показники контрольної групи (5,10±0,41). Натомість кількість МФ зі слабкою експресією у групі хворих з ХВН перевищувала контрольні показники у 12,8 разів (64,47±4,89 проти 5,04±0,39). Аналіз гістологічної та імуногістохімічної картини біоптатів шкіри у двох групах хворих після початку комплексного лікування через 7 діб відображає початкові регенераторні процеси. При цьому загальна кількість СD68-позитивних МФ зменшується в обох клінічних групах: незначно у першій групі (67,02±4,76 проти 74,07±5,19), та більш виразно у другій групі (46,14±3,74 проти 74,07±5,19). У цей період спостереження має місце значне зростання кількості МФ з вираженою експресією: до 26,04±1,95 у першій групі, та 19,09±1,51 у другій групі. Натомість кількість МФ зі слабкою експресією навпаки зменшувалась, причому більш інтенсивно у хворих другої групи (40,98±3,11 проти 27,05±2,25). На 14 добу дослідження відмічається подальше зменшення загальної кількості СD68позитивних МФ до 57,06±4,62 у першій групі, та 36,24±2,79 у другій групі. Аналогічні тенденції спостерігаються по відношенню і до кількості МФ з вираженою експресією. Так у першій групі їх кількість зменшується до 22,89±1,74, а у другій до 16,15±1,32. Кількість МФ зі слабкою експресією також зменшується в обох клінічних групах: до 34,17±2,73 у першій, та 20,09±1,49 у другій. Таким чином, загальна кількість МФ в дермі у процесі лікування знижується. При цьому відмічається значний ріст кількості МФ зі слабкою експресією CD68 на 7 добу від початку комплексного лікування. Натомість кількість МФ з вираженою експресією CD68 навпаки поступово збільшується, особливо в другій групі пацієнтів, у яких комплексне лікування доповнювалось призначенням репаранта та ентеросорбції. Аналогічні тенденції спостерігаються і на 14 добу від початку лікування, що також може слугувати критерієм ефективності запропонованого комплексного лікування. Запропонованій спосіб діагностики перебігу ранового процесу у трофічних виразках при ХВН нижніх кінцівок є точним та інформативним і виключає недоліки прототипу. 2 UA 119601 U Таблиця Оцінка розподілу та інтенсивності експресії CD68 макрофагів у запальному інфільтраті трофічних виразок при хронічній венозній недостатності (М±m) Експресія CD68 Перша доба дослідження Загальний пул Виражена експресія Слабка експресія Експресія CD68 Загальний пул Виражена експресія Слабка експресія Експресія CD68 Загальний пул Виражена експресія Слабка експресія 5 Трофічні виразки при ХВH (n=12) 74,07±5,19* 9,60±0,64* 64,47±4,89* 7 доба дослідження I група (n=6) II група (n=6) 67,02±4,76*# 46,14±3,74* 26,04±1,95*# 19,09±1,51* 40,98±3,11*# 27,05±2,25* 14 доба дослідження І група(n=6) II група (n=6) 57,06±4,62*# 36,24±2,79*# 22,89±1,74*# 16,15±1,32*# 34,17±2,73*# 20,09±1,49*# Контроль (n=5) 10,14±0,79 5,10±0,41 5,04±0,39 Контроль(n=5) 10,14±0,79 5,10±0,41 5,04±0,39 Контроль (n=5) 10,14±0,79 5,10±0,41 5,04±0,39 Примітка: * - р