Спосіб отримання цитохрому-с

Реферат: Спосіб отримання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’язу ВРХ розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням. При цьому здійснюють додаткове очищення отриманого розчину цитохрому-С шляхом видалення іонів сульфату амонію заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі. UA 120089 U (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ЦИТОХРОМУ-С UA 120089 U UA 120089 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель відноситься до біотехнології отримання біологічно активних з’єднань, саме цитохрому-С, що може бути використаний в фармацевтичній промисловості та медицині для виготовлення антигіпоксичних лікарських засобів для нормалізації тканинного дихання, а також у науково-дослідницькій роботі. Відомий спосіб отримання цитохрому-С, що включає екстрагування подрібненого серцевого м'яза ссавців водним розчином сульфатів, підлужування, очищення на іонообмінних смолах з наступним виділенням цільового продукту, що відрізняється тим, що, з метою поліпшення якості цільового продукту, екстракцію проводять 0,25-0,75 % розчином сульфату амонію, потім підкислюють сірчаною кислотою при рН 4-5 і підлужують гідроокисом барію до рН 8-9 (Патент України № 1110). Недоліками відомого способу є невисокий ступінь очищення цільового продукту, так як заявлені в свідоцтві етапи очищення цитохрому-С є недостатніми для очищення продукту від іонів сульфату амонію, яким проводять осадження, це викликає необхідність в додаткових способах очищення продукту. Також відомий спосіб отримання цитохрому-С, що включає знежирення сердець свиней, великої рогатої худоби або коней. Підготовлену сировину подрібнюють з отриманням фаршу, потім екстрагують 2,5% розчином трихлороцтової кислоти при температурі 10-15°С і рН 3,9-4,2. Відокремлюють екстракт і здійснюють його сорбцію на катіоніті, урівноваженому дистильованою водою. Після завершення сорбції катіонів промивають дистильованою водою і аміачноамонійний буферним розчином. Потім проводять елюцію цитохрому C з катіоніту розчином сульфату амонію з наступним очищенням його діафільтрацією до повного видалення іонів сульфату амонію і концентрування цитохрому С ультрафільтрацією (Патент РФ № 2528061). Даний спосіб обраний в якості прототипу. За відомим способом очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію здійснюють шляхом діафільтрації та ультрафільтрації розчину цитохрому-С із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа. Недоліком відомого способу є значні втрати цільового продукту при проведенні очищення цитохрому-С від іонів сульфату амонію шляхом ультрафільтрації із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа. В основу корисної моделі поставлено задачу: за рахунок зміни процесу очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію отримати продукт з вищим ступенем чистоти та збільшити вихід цитохрому-С. Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’язу великої рогатої худоби (ВРХ) розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, відповідно до корисної моделі здійснюють додаткове очищення отриманого розчину цитохрому-С шляхом видалення іонів сульфату амонію заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі. Заморожування розчину здійснюють до температури -65°С протягом 12 годин з наступною ліофілізацією при величині вакууму 48±12 mТ при температурі 35±3°С не менше 4 годин. Спосіб отримання цитохрому-С, що заявляється, виконують наступним чином. Перероблені на фарш серця КРС вносять у реактор з підготовленим розчином амонію сульфату 2 %, вимішують та охолоджують до температури від 2°С до 8°С. Встановлюють рН 5 % розчином сірчаної кислоти (4,3±0,05), проводять екстракцію цитохрому при постійному перемішуванні у реакторі при температурі від 2°С до 8°С. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. В отриманому екстракті проводять осадження баластних білків розчином гідроокису барію при рН (8,5±0,05) та температурі від 2°С до 8°С. Після осадження розчин декантують, проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізносинеродистого або 0,01 М калію феррицианіду. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Після отримання елюату цитохрому проводять очищення, що включає в себе осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2°С до 8°С. Відділення баластних білків фільтрацією на воронці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,2±0,05) бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 2°С до 8°С. Отриманий осад відділяють центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Відповідно до технології, що заявляється, отриманий розчин 1 UA 120089 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 цитохрому-С заморожують та ліофілізують у вакуумі. Отриманий ліофілізат цитохрому-С розчиняють в розчині натрію хлориду 9 % та очищують шляхом проведення діафільтрації та ультрафільтрації розчину крізь касетні мембрани з порогом відсікання 100 КДа та проведенням стерилізуючої фільтрації крізь фільтруючу мембрану 0,22 мкм. Таким чином якість цільового продукту зростає та підвищується вихід продукту, що є особливо суттєвим при промисловому виробництві цитохрому-С та має вищий ступінь чистоти за рахунок проведення ліофілізації у вакуумі та кінцевої стерилізуючої фільтрації. При проведенні ліофілізації у вакуумі відбувається видалення іонів сульфату амонію з розчину цитохрому-С, про що свідчать показники якісного визначення наявності сульфатів (при додаванні до розчину цитохрому-С барію хлориду розчин залишається прозорим, що свідчить про відсутність сульфатів) та показник кількісного визначення цитохрому-С, який склав 103,10 % (при критерії прийнятності 90%). Ефективність способу підтверджується наступним прикладом: Приклад 1. 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м’язу ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-8°С розчином 2 % сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв. при температурі 2-8°С та обертах мішалки 25±2 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3±0,05 5% розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8°С протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації екстракту гідроокисом барію, в кількості 3 кг, при рН 8,5±0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізосинеродистого, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатному буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8°С. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8°С. Відділяють осад фільтруванням на воронці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 1 л розчину) при рН (4,2±0,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять ще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рН 7,5±0,05 3 % розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію залізосинеродистого, перемішують та фільтрують розчин на воронці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С 3 % розчином аміаку. Відповідно до технології, що заявляється, отриманий розчин цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та поміщують в камеру ліофільної установки. Набирають розрядження (900±100) mВаr та проводять заморожування розчину до температури (-65°С) протягом 12 годин. Після цього починають вакуумування і, при досягненні величини вакууму (48±12) mТ, протягом 15-20 годин підвищують температуру у камері до (35±3)°С та витримують при цій температурі не менше 4 годин. Отриманий ліофілізат збирають в єдину серію та розчиняють в 15 л 9% розчину натрію хлориду, встановлюють рН 6,5-7,0. Розчин піддають діафільтрації та ультрафільтрації крізь мембрани з порогом відсікання 100 КДа та наступній стерилізуючій фільтрації крізь мембрану з розміром пор 0,22 мкм. Таким чином, при проведенні ліофілізації у вакуумі відбувається видалення іонів сульфату амонію з розчину цитохрому-С, про що свідчать показники якісного визначення наявності сульфатів (при додаванні до розчину цитохрому-С барію хлориду розчин залишається прозорим, що свідчить про відсутність сульфатів) та показник кількісного визначення цитохрому-С, який склав 103,10 % (при критерії прийнятності 90%). Відповідно до технології, що заявляється, ліофілізація розчину полягає в тому, що розчин 2 UA 120089 U 5 10 15 цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та розміщують в камеру ліофільної установки. Набирають розрідження (900±100) mВаr та проводять заморожування розчину до температури (-65°С) протягом 12 годин. Після цього починають вакуумування і, при досягненні величини вакууму (48±12) mТ, протягом 15-20 годин підвищують температуру у камері до (35±3)°С та витримують при цій температурі не менше 4 годин. Протягом 12 годин відбувається повне заморожування усього об’єму розчину до температури (-65°С). Температура заморожування вибрана з розрахунку максимального видалення вологи з препарату, а тривалість витримки при заданій температурі вибрана з розрахунку об’єму серії виробництва цитохрому. При проведенні ліофілізації: задане значення температури (35±3)°С - температура, що є допустимою для нагрівання препаратів білкової природи не допускаючи порушення білкової структури та водночас дозволяє в повній мірі провести висушування препарату та видалити при іони сульфату амонію, величина вакууму (48±12) mТ, в свою чергу, не дозволяє утворюватись волозі при висушуванні, що забезпечує рівномірне та повне висушування. Тривалість витримки при температурі (35±3)°С також обумовлена об’ємом серії виробництва. Відсутність іонів сульфату амонію визначають контролем за якісним показником, що доводить відсутність сульфатів. Показник, що підтверджує зменшення втрат продукту при виробництві, є показник втрати маси при висушуванні, що склав 0,02 % (при критерії прийнятності 0,5 %). 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 1. Спосіб отримання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’яза ВРХ розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове очищення отриманого розчину цитохрому-С шляхом видалення іонів сульфату амонію заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що заморожування розчину здійснюють до температури -65°С протягом 12 годин з наступною ліофілізацією при величині вакууму 48±12 mТ при температурі 35±3°С не менше 4 годин. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3