Спосіб дослідження біохімічних та молекулярно-генетичних наслідків нейротравми та процесів нейрорегенерації серотонінергічної системи на моделі ех vivo в тканинній культурі n. raphe

Реферат: Спосіб дослідження біохімічних та молекулярно-генетичних наслідків нейротравми та процесів нейрорегенерації серотонінергічної системи на моделі ex vivo в тканинній культурі n. raphe є лабораторним методом дослідження, при якому сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура культивують при 37 °С та 5 % СО2 протягом 4 тижнів на середовищі DMEM (Ігла) із додаванням 10 % сироватки ВРХ (великої рогатої худоби), яке замінюють кожні 3 доби, піддають механічному травмуванню шляхом перетину нейритно-гліальних волокон у різних напрямках, промивають тричі фізіологічним розчином, культивують 2 тижня, по закінченні терміну культивування зразки фіксують та консервують для подальшого дослідження методами гістохімії, ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) та ІФА (імуноферментного аналізу). UA 120291 U (12) UA 120291 U UA 120291 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель, що заявляється належить до медицини та біології, зокрема нейробіохімії та молекулярної біології, і призначена для тестування наслідків нейротравми на молекулярногенетичному та біохімічному рівні, а також нейрорегенераторних властивостей біологічноактивних речовин та матеріалів. Доведено, що наслідки ЧМТ: больова чутливість, рухові, психічні, соматичні порушення пов'язaні з післятравматичними змінами в серотонінергічній регуляції. Серотонінергічні нейрони в ЦНС концентровані у стовбурі мозку у варолієвому мості та n. raphe. Тому дослідження наслідків травматичного ураження цієї структури дуже важливі для запобігання розвитку небажаних ускладнень. Недоліки існуючих методів. До останнього часу для дослідження наслідків черепно-мозкової травми (ЧМТ) використовували лабораторних тварин [1]. Але в цілому мозку після ЧМТ відбувається непрогнозована кількість взаємовпливаючих процесів, які неможливо врахувати та відокремити. Інтегрованість структур центральної нервової системи (ЦНС), взаємодія між клітинами різних типів заважає дослідженню причинно-наслідкових зв'язків в патогенезі ЧМТ. Такі обмеження гальмують подальший прогрес у передбаченні розвитку ускладнень та способів репарації окремих ушкоджених структур. Подальше вдосконалення методичних підходів для дослідження наслідків ЧМТ потребує створення моделі, що дозволяє вивчення ушкоджень з використанням ізольованих структур головного мозку. Особливо важливим це є для молекулярно-генетичних та біохімічних досліджень наслідків ЧМТ. В сучасних дослідженнях з метою вивчення впливу травматичного ушкодження на цільову популяцію клітин використовують ex vivo моделі травми. Доведено, що при використанні моделей ex vivo результати у 90 % випадків відповідають аналогічним результатам при моделюванні in vivo [2, 3]. Для дослідження впливу травматичного ушкодження на тканину головного мозку розроблено декілька моделей ex vivo: компресійна, динамічна, гідродинамічна, механічна (трансакція) [2, 3]. В сучасній науковій літературі висвітлюються також результати дослідження in vitro метаболізму серотонінергічних структур головного мозку в умовах травматичного ушкодження [4, 5, 6]. Найближчим прототипом є спосіб дослідження нейрорегенерації запропонований Mi-Sook Chang (2011) "Neuronal regeneration material screening method by ex vivo model" US 7947435B2. В основі його лежить принцип використання як моделі органотипових зрізів спинного мозку, які оброблялися токсичними речовинами з метою індукції демієлінізації та використовувалися в подальшому для аналізу нейрорегенеративного впливу стовбурових клітин та нейротрофічних факторів різного походження [7]. Задачею корисної моделі є розробка способу для визначення процесів, що виникають в серотонінергічній системі після травматичного ураження на молекулярно-генетичному та біохімічному рівнях. Це досягається тим, що зона n. raphe, яка містить тіла серотонінергічних нейронів, ізолюється в умовах ex vivo, культивується та на етапі культивування піддається травматичній механічній деструкції з подальшим дослідженням рівня серотоніну, його локалізації в тілах та відростках клітин, а також експресії комплексу генів, що регулюють серотоніногенез. Поставлена задача вирішується тим, що сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура культивують при 37 °C та 5 % СО2 протягом 4 тижнів на середовищі DMEM (Ігла) із додаванням 10 % сироватки ВРХ (великої рогатої худоби), яке замінюють кожні 3 доби, піддають механічному травмуванню шляхом перетину нейритно-гліальних волокон у різних напрямках, промивають тричі фізіологічним розчином, культивують 2 тижня, по закінченні терміну культивування зразки фіксують та консервують для подальшого дослідження методами гістохімії, ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) та ІФА (імуноферментного аналізу). Запропонований спосіб здійснюється наступним чином. Сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура культивуються при 37 °C та 5 % СО2 протягом 4 тижнів на середовищі DMEM (Ігла) з додаванням 10 % сироватки ВРХ (великої рогатої худоби), яке замінювали кожні 3 доби. Далі піддають механічному травмуванню шляхом перетину нейритно-гліальних волокон у різних напрямках. Далі промивають тричі фізіологічним розчином, культивують 2 тижня. По закінченні терміну культивування зразки фіксують та консервують для подальшого дослідження методами гістохімії, ПЛР та ІФА. Приклад 1. Сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура у вигляді довгострокової культури (4-5 тижнів) піддавали механічному травмуванню шляхом перетину нейритногліальних волокон у різних напрямках, згідно зі способом, запропонованим С. Lööv [8]. Через 2 тижні в культуральному матеріалі досліджували вміст серотоніну iмуноферментним методом, морфологію серотонінергічних нейронів при гістохімічному забарвленні за Фальком-Хілларпом, а також експресію генів-регуляторів серотоніногенезу Nkx 2.2, Lmx 1b, Pet 1, Tph 1, Tph 2, Sert 1 UA 120291 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 методом ЗТ-ПЛР. Встановлено зниження рівню серотоніну в культуральному матеріалі у 2,7 рази та відсутність експресії комплексу генів-регуляторів серотоніногенезу. Приклад 2. Сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура у вигляді довгострокової культури (4-5 тижнів) піддавали механічному травмуванню шляхом перетину нейритногліальних волокон у різних напрямках, згідно зі способом, запропонованим С. Lööv [8]. До травмованих зрізів додавали популяцію фетальних нервових клітин Е16 зони ядер шва (10 млн/мл), в яких попередньо стимулювали серотоніногенез в умовах in vitro, протягом 1 тижня, піддаючи впливу BDNF (brain derived neurotrophic factor) в концентрації 50 нг/мл. Через 2 тижні в культуральному матеріалі досліджували вміст серотоніну iмуноферментним методом, морфологію серотонінергічних нейронів при гістохімічному забарвленні за Фальком-Хілларпом, а також експресію генів-регуляторів серотоніногенезу Nkx 2.2, Lmx 1b, Pet 1, Tph 1, Tph 2, Sert методом ЗТ-ПЛР. Встановлено зростання рівня серотоніну в 1,4 рази у порівнянні з контрольними зразками, що підлягали експериментальній травмі, а також поява експресії Nkx 2.2, Lmx 1b, Pet 1, Tph 1, Tph 2, Sert. Приклад 3. Сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура у вигляді довгострокової культури (4-5 тижнів) піддавали механічному травмуванню шляхом перетину нейритногліальних волокон у різних напрямках згідно способу, запропонованому С. Lööv [8]. До травмованих зрізів додавали 30 % кондиційного середовища від культивованих фетальних нервових клітин Е16 зони ядер шва, в яких попередньо стимулювали серотоніногенез в умовах in vitro, протягом 1 тижня піддаючи впливу BDNF (brain derived neurotrophic factor) в концентрації 50 нг/мл. Через 2 тижні в культуральному матеріалі досліджували вміст серотоніну iмуноферментним методом, морфологію серотонінергічних нейронів при гістохімічному забарвленні за Фальком-Хілларпом, а також експресію генів-регуляторів серотоніногенезу Nkx 2.2, Lmx 1b, Pet 1, Tph 1, Tph 2, Sert методом ЗТ-ПЛР. Встановлено зростання рівню серотоніну в 1,7 рази у порівнянні з контрольними зразками, що підлягали експериментальній травмі, а також поява експресії Nkx 2.2, Pet1. Таким чином, запропонований нами спосіб дослідження нейротравми та процесів нейрорегенерації на моделі ex vivo дає можливість проаналізувати наслідки ушкодження серотонінергічних нейронів на біохімічному та молекулярно-генетичному рівні та оцінити активність регенераційних процесів, як самодовільних, так і стимульованих. У порівнянні із прототипом, запропонований спосіб має ряд переваг: - комплексність дослідження, а саме можливість застосовувати різні методи, наприклад біохімічні та молекулярно-генетичні, на одному зразку. Чітка паралельність результатів. - відсутність не прогнозованого стороннього впливу з боку інших структур мозку та систем організму. - можливість спостерігати за процесом в динаміці. - економічний та етичний аспект - зменшення кількості дослідних тварин, швидка декапітація, відсутність етапу нанесення ЧМТ. - універсальна можливість дослідити і оцінити вплив будь-яких агентів, що мають нейрорегенераторний потенціал. Джерела інформації: 1. Лукьянов Т.Т. Устройство для нанесения черепно-мозговой травмы, в кн.: Рационализаторские предложения и изобретения в медицине. - К., 1979. - С. 89-91. 2. Morrison В 3rd, Elkin BS, Dolle JP, Yarmush ML. In vitro models of traumatic brain injury. Annu Rev Biomed Eng. 2011. - 13: 91-126. 3. Kumaria A, Tolias C.M. In vitro models of neurotrauma. Br J Neurosurg. 2008. - 22: 200-206. 4. Higuchi M, Suzuki Y, Yatani Y. Augmentation of serotonin release by sustained exposure to MDMA and methamphetamine in rat organotypic mesencephalic slice cultures containing raphe serotonergic neurons. J. of Neurochemistry. 2008. - 106: 2410-2420. 5. Nagayasu K, Yatani Y, Kitaichi M. Utilitary of organotypic raphe slice cultures to investigate the effects of sustained exposure to selective 5-HT reuptake inhibitors on 5-HT release British. Jornal of Pharmacology. 2010. - 161: 1527-1541. 6. Daviaud N, Garbayo E, Lautram N. Modeling nigrostriatal degeneration in organotipic cultures, a new ex vivo model of Parkinson's disease. Neuroscience. 2014. - 256: 10-22. 7. US 7947435 B2 Neuronal regeneration material screening method ex vivo model. Mi-Sook Chang 24.05.2011. Заявл 19.01.2007; Опубл. 24.05.2011. 8. Lööv С., Shevchenko G, Nadadhur G. Identification of injury specific proteins in a cell culture model of traumatic brain injury. Retrived from: http://joumals.plos.org/plosone/article?id=10,1371/journal.pone.0055983. 60 2 UA 120291 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб дослідження біохімічних та молекулярно-генетичних наслідків нейротравми та процесів нейрорегенерації серотонінергічної системи на моделі ex vivo в тканинній культурі n. raphe, що є лабораторним методом дослідження, який відрізняється тим, що сагітальні зрізи зони ядер шва новонародженого щура культивують при 37 °С та 5 % СО2 протягом 4 тижнів на середовищі DMEM (Ігла) із додаванням 10 % сироватки ВРХ (великої рогатої худоби), яке замінюють кожні 3 доби, піддають механічному травмуванню шляхом перетину нейритно-гліальних волокон у різних напрямках, промивають тричі фізіологічним розчином, культивують 2 тижня, по закінченні терміну культивування зразки фіксують та консервують для подальшого дослідження методами гістохімії, ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) та ІФА (імуноферментного аналізу). Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3