Спосіб дослідження окиснювальної модифікації білків в трофобласті і-го триместру вагітності

Реферат: Спосіб дослідження окиснювальної модифікації білків в трофобласті I-го триместру вагітності шляхом дослідження окиснювальної модифікації білків із застосуванням барвника бромфенолового синього та комп'ютерного мікроспектрофотометричного аналізу цифрових копій оптичних зображень для кількісної оцінки. Проводять хімічну фіксацію препаратіввідбитків попередньо подрібнених ворсинок хоріону на предметних скельцях з електричним принципом клітинної адгезії у парах параформальдегіду, гістохімічне забарвлення проводять 0,1 % розчином бромфенолового синього у 95°-му етанолі, промивають у двох порціях 95°-го етанолу. UA 121631 U (12) UA 121631 U UA 121631 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме до акушерства, і може бути використана для морфологічної діагностики хвороб, при яких активізуються вільнорадикальні процеси в трофобласті в 1-му триместрі вагітності, зокрема, зростає інтенсивність окиснювальної модифікації білків, наприклад, інфекційні захворювання, анемії, інтоксикації, захворювання легень тощо. Ураження трофобласта є однією з ознак недостатності плаценти, а зростання окиснювальної модифікації білків у трофобласті - є одним із варіантів його ушкодження. Тому, вкрай важливим для практичної медицини є удосконалення діагностики змін в трофобласті при різних захворюваннях вагітних. Спосіб є корисним для діагностики недостатності плаценти. Найближчим аналогом корисної моделі є спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у тканині печінки [Спосіб вимірювання окиснювальної модифікації білків у тканині печінки: пат. 38260 Україна. № и200810681; заявл. 27.08.2008; опубл. 25.12.2008, бюл. №24], в якому досліджували гістологічні парафінові зрізи печінки, які попередньо піддавали хімічній фіксації на звичайних чистих знежирених предметних скельцях в нейтральному забуференому розчині формаліну, потім проводили гістохімічне забарвлення бромфеноловим синім при низькому рН "кислих" та "основних" білків за методом Мікель-Кальво, та проводили комп'ютерний мікроспектрофотометричний аналіз цифрових копій оптичних зображень для кількісної оцінки. Недоліком прототипу-способу є те, що не враховано, що хоріон 1-го триместру вагітності на відміну від пізніх термінів вагітності характеризується високим ступенем рихлості, так як є незрілим, і для хімічної фіксації використовують чисті знежирені предметні скельця, які володіють порівняно низькими адгезивними властивостями щодо фрагментів трофобласта, та водний розчин формальдегіду; гістохімічне забарвлення проводять високо кислотним робочим розчином барвника бромфенолового синього та використовують диференціюючий водний розчин, що призводить до значного руйнування фрагментів трофобласта на препаратахвідбитках. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити спосіб дослідження окиснювальної модифікації білків в трофобласті 1-го триместру вагітності шляхом проведення хімічної фіксації препаратів-відбитків попередньо подрібнених ворсинок хоріону на предметних скельцях з електричним принципом клітинної адгезії у парах параформальдегіду, гістохімічного забарвлення 0,1 % розчином бромфенолового синього у 95 -му етанолі, промивання у двох порціях 95°-го етанолу. Спільними ознаками корисної моделі та найближчого аналога є дослідження окиснювальної модифікації білків із застосуванням барвника бромфенолового синього та комп'ютерного мікроспектрофотометричного аналізу цифрових копій оптичних зображень для кількісної оцінки. Відмінними ознаками корисної моделі від найближчого аналога є те, що проводять хімічну фіксацію препаратів-відбитків попередньо подрібнених ворсинок хоріону на предметних скельцях з електричним принципом клітинної адгезії у парах параформальдегіду, гістохімічне забарвлення проводять 0,1 % розчином бромфенолового синього у 95°-му етанолі, промивають у двох порціях 95°-го етанолу. Відмінності корисної моделі від найближчого аналога вказані у наступній таблиці. Таблиця Відмінність корисної моделі від найближчого аналога за ознаками Ознака Найближчий аналог Гістологічний матеріал препарат-відбиток зрізу Предметні скельця чисті знежирені Фіксація Робочий розчин барвника водний розчин формальдегіду кислотний розчин бром фенолового синього Диференціюючим розчином з кислотами та водою Фінальне промивання 45 Корисна модель препарат-відбиток попередньо подрібнених ворсинок хоріону з електричним принципом клітинної адгезії пари параформальдегіду етаноловий розчин бромфенолового синього 95 -м етанолом Визначення термінів, які використовуються при описі корисної моделі: окиснювальна модифікація білків, трофобласт 1-го триместру вагітності, препарати-відбитки. Теоретичні передумови здійснення способу, що заявляється. 1 UA 121631 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 При різних захворюваннях закономірно повинні зазнавати суттєвих змін показники окиснювальної модифікації білків. Так, індекс R/B (міра окиснювальної модифікації білків) зростає в епітеліальних клітинах в порівнянні з практично здоровими особами при ангінах, дерматитах, епітеліальних пухлинах різних органів, в трофобласті плаценти при залізодефіцитній анемії вагітних та інших захворюваннях. Відомо, що висока кислотність робочого розчину барвника бромфенолового синього та диференціюючого розчину призводить до значного руйнування фрагментів трофобласта на препаратах-відбитках, окрім того, фрагменти трофобласта на відміну, наприклад, від клітин крові, значно гірше утримуються на чистих предметних скельцях внаслідок порівняно низьких адгезивних властивостей епітеліальних клітин, а застосування ж класичних білкових плівкових покриттів для підвищення адгезії клітин до скла (наприклад, яєчний білок чи білок сироватки крові) непридатні для гістохімічної методики на окиснювальну модифікацію білків, так як білкове покриття предметного скельця так само дає позитивну реакцію на білок, як і білки клітин, тому частково перекриває позитивну реакцію в трофобласті і тому перешкоджає отриманню істинних результатів дослідження. Важливим є й те, що хоріон 1-го триместру вагітності на відміну від пізніх термінів вагітності характеризується високим ступенем рихлості (так як хоріон незрілий), тому звичайний спосіб виготовлення препаратів відбитків з нього (шляхом одного розрізу і відбиванням поверхні розрізу на предметному склі) є малоефективним, так як на предметному склі залишається недостатня кількість фрагментів трофобласта для отримання надійних з точки зору статистики результатів дослідження. Використання для фіксації препаратів-відбитків предметних скелець з електричним принципом клітинної адгезії та саме у парах параформальдегіду замість водного розчину формальдегіду чи водних розчинів інших хімічних фіксаторів значно покращує електричну адгезію епітеліальних клітин до предметних скелець і є важливим засобом збереження структур фрагментів трофобласта на предметних скельцях. Отже, у корисній моделі пропонується спосіб для покращення візуалізації саме трофобласта та для максимального збереження цілісності його структур. Корисна модель здійснюється наступним чином. У вагітної беруть свіжий хоріон (абортивний матеріал), попередньо гострим лезом здійснюють подрібнення ворсинок хоріону (міру подрібнення визначають індивідуально, залежно від ступеня рихлості хоріону та задач дослідження), при цьому препарат-відбиток роблять за допомогою предметного скельця з фабричною електричною адгезію, наприклад, предметні скельця "SuperFrost®» або "Histobond®», далі препарат-відбиток висушують не менше ніж протягом 20 хвилин при температурі 20-25 °C і відносній вологості не більше 70 %. Висушений препарат-відбиток з метою хімічної фіксації розміщують в закритій ємності (наприклад, в ексикаторі) разом з присутнім там параформальдегідом на 10-15 хвилин, далі препарат-відбиток занурюють у робочий розчин барвника (0,1 % розчин бромфенолового синього у 95°-му етанолі) і тримають у ньому при 20-25 °C протягом 8 хвилин, після чого промивають у двох порціях чистого (95°-го) етанолу і висушують протягом 10 хвилин, потім за допомогою оптичного мікроскопа та цифрової фотокамери роблять цифрову кольорову копію оптичного зображення фрагментів трофобласта препарату-відбитка і засобами комп'ютерної програми ImageJ отримують мікроспектрофотометричні показники R та В, на основі яких розраховують індекс R/B, який є мірою окиснювальної модифікації білків. Приклади застосування корисної моделі. Застосування запропонованого способу показало на практиці свою ефективність у прогнозуванні тяжкості перебігу плацентарної недостатності у 1-му триместрі вагітності за станом ушкодження трофобласта, що є однією із найбільш суттєвих ознак плацентарної недостатності, та індексом окиснювальної модифікації білків, що при його підвищенні є одним із ранніх проявів ушкодження клітини при підсиленні вільно-радикальних процесів. Технічний результат. Запропонований спосіб дозволяє ефективно досліджувати окиснювальну модифікацію білків в трофобласті 1-го триместру вагітності шляхом покращення візуалізації трофобласта із максимальним збереженням цілісності його структур у препаратахвідбитках хоріону при визначенні індексу окиснювальної модифікації білків. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб дослідження окиснювальної модифікації білків в трофобласті I-го триместру вагітності шляхом дослідження окиснювальної модифікації білків із застосуванням барвника бромфенолового синього та комп'ютерного мікроспектрофотометричного аналізу цифрових копій оптичних зображень для кількісної оцінки, який відрізняється тим, що проводять хімічну 2 UA 121631 U фіксацію препаратів-відбитків попередньо подрібнених ворсинок хоріону на предметних скельцях з електричним принципом клітинної адгезії у парах параформальдегіду, гістохімічне забарвлення проводять 0,1 % розчином бромфенолового синього у 95°-му етанолі, промивають у двох порціях 95°-го етанолу. 5 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3