Спосіб визначення біотрансформації сполуки n(1),n(1′)-(2″-бром-2″-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил), яка має виражені протипухлинні властивості

Спосіб визначення біотрансформації сполуки N(1),N(1')-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5фторурацил), яка має виражені протипухлинні властивості, шляхом проведення тонкошарової 3 30779 4 сполука ФП-8 піднімається розчинниками по Введення фтор(галоген) вмісних пластинці двома окремими плямами, (таблиця 1), фармакофорів в гетероциклічну молекулу (рисунок 1). призводить до підвищення розчинності сполук в ліпідах та робить лікарські засоби ефективнішими у зв'язку із легкістю їх транспорту в організмі [1, 2]. Суть корисної моделі полягає в тому , що до Дані щодо розподілу на хроматограмі чистих речовин: 5-фто проведення хроматографування щурам-носіям пухлини вводять розчин сполуки N(1), N(1’) -(2"-бромкислоти та її солі у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчин 2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) від 25мг/кг до 32мг/кг, через 30 хвилин проводять забір крові та Назва сполуки Стан (знаходження) отримують витяжку з пухлини, хроматографують 5-фторурацил чиста речовина, розчин в метан окремо, результати хроматогоафування дифенілфосфорна кислота чиста речовина, розчин в метан порівнюють з результатами контролю і при дифенілфосфорної кислоти чиста речовина, розчин в метан виявленні відповідного рівню розташування плям натрієва сіль на хроматограмі обох сполук визначають ФП-8 Розчин препарату в метанолі біотрансформацію сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил). Спосіб здійснюється наступним чином: в На Фіг.1 зображена хроматограма розподілу умовах in vivo та in vitro за допомогою методу чистих речовин: 5-фторурацилу, тонкошарової хроматографії (далі, ТШХ), що дифенілфосфорної кислоти ті її солі у порівнянні с виконувався на пластинці - сілікагель F254 у препаратом ФП-8 в системі розчинників: системі розчинників - хлороформ-спирт 96% у хлороформ-спирт - 96% (2:1). співвідношенні 2:1, під час вивчення Де: 1. Розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та протипухлинної активності сполуки на моделях Rf~0,6). 2. розчин 5-фторурацилу в метанолі експериментального пухлинного зросту різного (Rf~0,6). 3. розчин натрієвої солі дифеніл гістогенезу: Лімфосаркомі Пліса, Карциномі фосфорної кислоти в метанолі (Rf~0,18). Інших Герена, Саркомі 45. плям не спостерігається. Сполуку N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-бісРечовина ФП-8 являє собою координаційну (5-фторурацил) (далі сполука), яка має виражені структуру (сполуку) 5-фторурацилу та натрієвої протипухлинні властивості, отримана шляхом солі дифенілфосфорної кислоти. Спочатку взаємодії відомого реагенту та складової підібрали хроматографічну пластинку та систему лікарських засобів 5-фторурацилу з фторотаном розчинників, щоб пляма речовини піднімалася зі молярному співвідношенні 2:1,5 [3, 4]. старту та була компактною. Пластинка - сілікагель Реакції проводилися у системі розчинників F254, система розчинників - хлороформ-спирт 96% (бензол-диметилформамід) в умовах міжфазного у співвідношенні 2:1. Після елюювання та каталізу дибензо-18-краун-6-ефіром в лужному висушування пластинку проявляли в УФ-світлі при середовищі з метою забезпечення отримання довжині хвилі 254нм. В наданій системі сполуки N(1), N(1)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5розчинників (як і в інших, менш ефективних), фторурацил)-у, яка має виражені протипухлинні досліджуваний препарат піднімався по пластинці властивості. двома окремими плямами. Щоб впевнитись, що ці Були проведені випробування in vivo по плями відповідають 5-фторурацилу та натрієвій розподілу сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"солі дифенілфосфорної кислоти, на одну хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) в організмі пластинку поряд з препаратом окремо наносили тварини. розчини його складових. Експерименти щодо визначення На хроматограмі чітко видно, що сполука ФП-8 біотранформації сполуки в організмі піддослідної піднімається на пластинці двома окремими тварини проведені на щурах з масою тіла 160±20г плямами, які відповідають хроматограмам (кількість тварин - 10). розчинів 5-фторурацилу і дифенілфосфорної Оскільки структурні аналоги сполуки в кислоти. При цьому пляма дифенілфосфорної літературі не описано препаратами порівняння кислоти в препараті дещо нижче, ніж відповідна були відібрані 5-фторурацил та препарат ФП-8 пляма в окремому розчині. (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль На другому етапі дослідження проведені дифенілфосфорної кислоти). випробування in vivo по розподілу сполуки N(1), Критерієм оцінки вважалася відповідність N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) в розташування плям досліджуваних сполук на організмі тварини. хроматограмі після проявлення їх за допомогою Розподіл сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"опромінення в УФ-світлі при довжині хвилі 254нм. хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) в організмі щураНа першому етапі дослідження з метою пухлиноносія досліджували методом тонкошарової отримання даних по розподілу чистих речовин на хроматографії у порівнянні із препаратом хроматограмі хроматогрували досліджувані стандартом 5-фторурацилом та препаратом ФП-8 розчини чистих речовин - 5-фторурацилу, (складові: 5-фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти та її солі у порівнянні з дифенілфосфорної кислоти). препаратом ФП-8 (складові: 5-фторурацил та Спочатку з метою отримання даних по натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти) в розподілу чистих речовин на хроматограмі системі розчинніків: хлороформ-спирт 96 % (2:1). хроматогрували досліджувані розчини чистих Отримані хроматограми підтверджують, що речовин - N , N -(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5(1) (1’) 5 30779 6 фторурацил), 5-фторурацилу у порівнянні з розчином (суспензії центрифугували протягом препаратом ФП-8 (складові: 5-фторурацил та 40хв. при 8000об/хв). натрієва сіль дифенілфосфорної кислоти) в Надосадочні рідини наносили на пластинку системі розчинніків: хлороформ-спирт 96% (2:1) одразу після одержання (пластинка - сілікагель F254, система розчинніків - хлороформ-спирт 96% у при t°20,6°'C. співвідношенні 2:1; проявлення - УФ-опромінення. Для отримання хроматограми готували У якості препаратів-стандартів використовували 5розчини: фторурацил та препарат ФП-8. - N(1), N(1’) -(2"-бром- 2"-хлоретеніл)-біс-(5Із наведеної хроматограми видно, що в фторурацил) - у 10мг в 5мл спирту 96% (10мкл); сиворотці крові знаходиться 5-фторурацил - 5-фторурацилу 5 мг в 10 мл спирту 96 % (10 метаболіт сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"мкл); хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) - пляма менш - ФП-8 10мг в 10мл спирту 96% (10мкл). насичена, ніж на хроматограмі розподілу чистих За методикою виконувалася процедура речовин: N(1), N(1’)-(2"-бром- 2"-хлоретеніл)-біс-(5хроматографування: пластинка - сілікагель F254, фторурацил), 5-фторурацилу у порівнянні з система розчинників - хлороформ-спирт 96% у препаратом ФП-8 в системі розчинніків: співвідношенні 2:1. Після елюювання та хлороформ-спирт 96% (2:1) при t°20,6°C. Також висушування пластинку проявляли в УФ-світлі при довжині хвилі 254нм. В наданій системі спостерігаються більш насичені плями, що розчинників досліджувана сполука N(1), N(1’)-(2"відповідають складовим препарату ФП-8 (5бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) та 5фторурацил та натрієва сіль дифенілфосфорної фторурацил піднімалися по пластинці однією кислоти) та 5-фторурацилу, (Фіг.3). плямою (для кожної сполуки), що знаходилися на На Фіг.3 зображена хроматограма розподілу одному рівні. На хроматограмі чітко видно, що діючої речовини: N(1), N(1’) -(2"-бром-2"-хлоретеніл)сполука ФП-8 піднімається на пластинці двома біс-(5-фторурацил)-у в сиворотці крові окремими плямами, які відповідають піддослідної тварини, препаратів-стандартів, хроматограмам розчинів 5-фторурацилу та N(1), штучно нанесених на хроматографічну пластинку, N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) і 5-фторурацилу, та препарату ФП-8 в системі дифенілфосфорної кислоти, (таблиця 2), (рисунок розчинників: хлороформ-спирт - 96% (2:1). 2). Де: 1. Сироватка крові – пляма метаболіту сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5фторурацил)-у 5-фторурацилу (Rf~0,6). Таблиця 2 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. розчин ФП-8 Дані щодо розподілу на хроматограмі чистих речовин: в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил)-у, 5-фторурацилу На хроматограмі (Фіг.4) екстракту із пухлини плям багато, але 96 % (2:1) пляма, відповідна у порівнянні з препаратом ФП-8 в системі розчинніків: хлороформ-спирт присутня при t°20,6°C. метаболіту сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил)-у - 5-фторурацилу, Назва сполуки Стан (знаходження) Значення Rf а також плями препаратів-стандартів, штучно N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)чиста речовина, розчин в метанолі хроматографічну пластинку, 50,6 нанесених на біс-(5-фторурацил) фторурацилу та препарату 0,6 ФП-8 в системі 5-фторурацил чиста речовина, розчин в метанолі розчинників: хлороформ-спирт 0,15 (2:1). 96% ФП-8 Розчин препарату в метанолі На Фіг.4 зображена хроматограма розподілу 0,6 діючої речовини: N(1), N(1’) -(2"-бром-2"-хлоретеніл)біс-(5-фторурацил)-у в витяжці з пухлини На Фіг.2 зображена хроматограма розподілу піддослідної тварини, препаратів-стандартів, чистих речовин: N(1), N(1’) -(2"-бром-2"-хлоретеніл)штучно нанесених на хроматографічну пластинку, біс-(5-фторурацил)у 5-фторурацилу, у порівнянні с 5-фторурацилу, та препарату ФП-8 в системі препаратом ФП-8 в системі розчинників: розчинників: хлороформ-спирт - 96% (2:1). хлороформ-спирт - 96% (2:1) при t°20,6°C. Де: 1. Витяжка з пухлини – пляма метаболіту Де: 1. Розчин N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5біс-(5-фторурацил) в метанолі (Rf~0,6). 2. розчин фторурацил)-у 5-фторурацилу (Rf~0,6). 2. Розчин 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. розчин ФП-8 5-фторурацилу в метанолі (Rf~0,6). 3. розчин ФП-8 в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6) . Інших плям не в метанолі (Rf~0,15 та Rf~0,6). спостерігається. Із наведених хроматограм (Фіг.3, 4) видно, що Для проведення випробування in vivo по 5-фторурацил є і в сироватці крові і в витяжці з розподілу сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"пухлини піддослідної тварини через 30хв. після хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) в організмі введення лікарської дози сполуки N(1), N(1’)-(2"тварини, у піддослідного щура-носія пухлини через бром- 2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил), (таблиця 30хв. після введення лікарської дози (від 25 до 3). 32мг/кг) сполуки N(1), N(1’) -(2"-бром-2"-хлоретеніл)біс-(5-фторурацил) брали кров та пухлину. Із крові одержували центрифугуванням сироватку, а із подрібненої пухлини проводили екстракцію Дані щодо розподілу на хроматограмі плям речовини N(1), N(1’) -(2"-бр сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5яка міститься в сироватці крові та у витяжці з пухлини піддослідної тв фторурацил) ізоаміловим спиртом та ізотонічним нанесених на хроматографічну пластинку, 5-фторурацилу у порів розчинників: хлороформ-спирт 96 % 7 30779 8 фторурацилу речовина 1,1'-(2"-бром-2"хлоретенил)-біс-(5-фторурацил)-у, Rf яка має Назва сполуки Стан (знаходження) Значення протипухлинну активність. Деклараційний патент N(1), N(1)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)сироватка крові 0,6 на винахід. Дата прийняття рішення 24.02.2004. біс-(5-фторурацил) 59324А 7С01В 7/09, С07С 21/00. Бюлетень № 8. N(1), N(1)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)витяжка з пухлини 0,6 біс-(5-фторурацил) 5-фторурацил чиста речовина, розчин в метанолі 0,6 0,15 ФП-8 розчин препарату в метанолі 0,6 Таким чином, сполука N(1), N(1’)-(2"-бром-2"хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) може утворювати діючі фрагменти молекули in vitro (5-фторурацил та фрагмент молекули фторотану з фармакофорними властивостями =С=СВrС l), що має бути властивістю всієї групи близьких за будовою сполук (схема 1). Схема 1. O HN O N F Br Cl C C O O NH N O F N(1), N(1')-(2"-бром-2"-хлоретеніл)біс-(5-фторурацил) metabolism F HN O +ClBrC=C N H 5-фторурацил фрагмент молекули фторотану Завданням корисної моделі є спосіб визначення біотранформації біс-адукту N(1), N(1’)(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил), яка має виражені протипухлинні властивості, в умовах in vivo та in vitro за допомогою методу ТШХ (пластинка - сілікагель F254, система розчинників хлороформ-спирт 96% у співвідношенні 2:1) під час вивчення протипухлинної активності сполуки на моделях експериментального пухлинного зросту різного гістогенезу: Лімфосаркомі Пліса, Карциномі Герена, Саркомі 45. В результаті дослідження за допомогою хроматографічного методу знайдено, що 5фторурацил є і в сироватці крові і в витяжці з пухлини піддослідної тварини через 30хв. після введення лікарської дози сполуки N(1), N(1’)-(2"бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил). Таким чином, можна вважати, що основним метаболітом сполуки N(1), N(1’)-(2"-бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5фторурацил) є 5-фторурацил. Спосіб визначення біотранформації в умовах in vivo та in vitro біс-адукту N(1), N(1’)-(2"-бром-2"хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил) розроблено у відділі онкофармакології Інституту фармакології та токсикології АМН України. Література: 1. Соединения фтора. Синтез и применение. / Под ред. Н. Исикава. - М.: Мир, 1990. - Гл. 5. - С. 183-265. 2. Ягупольский Л.М. // Ароматические и гетероциклические соединения с фторсодержащими заместителями. Киев: Наукова думка, 1988. - С. 90-105. 3. Вельчинська О.В. Спосіб отримання речовини з протипухлинною активністю 1,1'-(2"бром-2"-хлоретеніл)-біс-(5-фторурацил). Деклараційний патент на корисну модель. 6893. C07D 239/553, С07С 21/18, 21/185, А61К 33/16. Дата прийняття рішення 16.05.2005. Бюл. № 5. С. 6893. 4. Стефанов О.Ю Вельчинська О.В., Шарикина H.I., Кудрявцева І.Г. Похідне фторотану та 5 9 30779 10