Спосіб визначення недостатності лімфовідтоку нирки

МПКГ6С 01 N 33/48 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ НЕДОСТАТНОСТІ ЛІМФОВІДТОКУ НИРКИ Винахід має відношення до медицини, а саме до нефрології та трансплантологи і може бути використаним в експериментальній, а також клінічній практиці для виявлення порушень лімфовідтоку нефротрансплантатів та інтраренальної недостатності лімфатичної системи при захворюваннях нирок. Відомі способи визначення недостатності лімфообігу в нирці, які зосновані на виявленні в тканинах органу морфологічних ознак лімфостазу після візуалізації інтраренального лімфатичного русла завдяки інтерстиціальним введенням у видалену з організму нирку лімфотропного барвника з наступним світломікроскопічним дослідженням мікропрєпаратїв (1,2,3). Недоліки аналогів полягають в їх непридатності для суправітального та динамічного визначення недостатності лімфообігу в нирці із-за неможливості реалізувати цю методику на маленькому шматочку тканини нефробіоптату. Недоліків аналогів позбавлений спосіб, заснований на виявленні морфологічних ознак лімфостазу в прижиттєво видаленому шматочку ниркової тканини під час його ультраструктурного дослідження (4) - п р о т о т и п. Недоліками прототипу є низька точність та мала інформативність, зумовлені трудношами виявлення елементів інтраренальної лімфоциркуляторної мікросудинної мережі в межах плошини ультратонкого зрізу нефробіоптату через відносно низьку щільність їх розподілу в нирковій тканині. Метою винаходу є підвищення точності способу. Реалізація мети вперше дає можливість достовірно визначити недостатність лімфовідтоку нефротрансплантата за результатами електронно-мікроскопічного дослідження ультратонкого зрізу прижиттєво видаленого нефробіоптату. Мета досягається тим, що виконують біопсію зовнішньо-кортикального шару нирки, досліджують електронно-мікроскопічно 10-20 клітин декількох проксимальних звивистих канальнів; під час дослідження стереометрично визначають на електроннограмах питомий об'єм прозорих піноцитозних вакуолей (ПОВ) цитоплазми, розраховують величину відношення кількості контактуючих з вакуолями лізосом до загального числа досліджених клітин вибірки, та при значенні першого показника, який перевищує 0,1- а другого - більше 0,2, констатують недостатність ренального лімфовідтоку. Спосіб здійснюють таким чином. Виконують транскутанну або інтраопераиійну біопсію зовнішньо-кортикального шару нирки, фіксують вилучений шматочок тканини глютаральдегідом та осмієвою кислотою, обезводнюють його спиртами та ацетоном, заливають в епоно-аралдитний блок, виготовлюють з останнього ультратонкий (40 нм^ зріз, контрастують його уранілаиетатом та цитратом свинцю, монтують на сіточку з паладію, досліджують зріз в трансмісійному мікроскопі, фотографують 10-20 "випадкових" цілих клітин з декількох проксимальних звивистих канальців при стандартизованому збільшенні, виявляють методом точкового обліку ПОВ цитоплазми в електронограмах тубулоцитів, розраховують середню величину відношення кількості контактуючих з вакуолями лізосом до числа досліджених клітин, та при значеннях першого параметру, які перевищують 0.1. а другого - більше 0.2. констатують недостатність ренального лімфообігу. Спосіб ілюструється прикладами. Приклад 1. Безпородній собаці під внутрішньовенним кетаміновим наркозом за допомогою голки НДІКЕХ через поперекову ділянку зробили лівобічну транскутанну нефробіопсію та витягли стовпчик тканини з зовнішньо-кортикального шару нирки. Відсічений гострим лезом шматочок біоптату з субкапсулярних тканин кортикального шару 1 ммЗ після його фіксації, заливання в епоно-аралдитний блок та різання на ультрамікротомі "LKB-IIF\ піддали електронно-мікроскопічному дослідженню в трансмісійному мікроскопі "JEM-100C". В процесі дослідження загальної морфологічної картини ультратонкого (40 нм') зрізу сфотографували 20 цілих клітин з декількох проксимальних звивистих канальиів на всю їх величину при збільшенні 5 000. Із знятих фотопластинок надрукували фотознімки каймистих тубулоцитів, доводячи їх збільшення до 15 000. Потім зробили "кидки" морфометричної сітки Автанділова на кожну електронограму клітини - по 5 разів на кожен фотознімок та методом точкового обліку за Глаголєвим в кожному знімку підраховували сумарну кількість крапок (№к\ які випали на клітину в результаті зроблених кидків: №к=Х»к1+№к24Х»кЗ+№к4+№к5=2І2+214+221+217+219=ІО83: а також загальну кількість крапок ґ№в\ які попалися при цьому на електронно-прозорі піноцитозні вакуолі цитоплазми клітини: №в=№в 1 +№в2+ХмЗ+№в4+№в5=16+19+18 И0+19-82. За результатами точкового обліку відповідно теоремі Глаголева розрахували величини ПОВ в першій дослідженій клітині: ПОВ1=№в/№к=82/1063=0,076. Аналогічні розрахунки зробили для кожної з 20 знятих клітин виборки. тобто ПОВ2. ПОВЗ ... ПОВ20. на підставі яких визначили середню величину ПОВ в клітинах проксимальних звивистих канальців: ПОВЧПОВ1+ПОВ2+... +ПОВ20 V20=O.07O+0,010. На всю вибірку із 20 електронограм в в межах цитоплазми клітин різних проксимальних звивистих канальців не було виявлено жодної контактуючої з піношітозними вакуолями електронно-шільної лізосоми. на підставі чого вважали, шо коефіцієнт "контактних" лізосом (КЛ) - величина відношення контактуючих з вакуолями лізосом (№л) до числа досліджених клітин, дорівнює нулю: з, КЛ-№л/20=0/20=0. Таким чином, оскільки величина ПОВ в клітинах проксимальних звивистих канальні в нирки не перевищує 0.1. а КЛ в них менше 0,2. то в дослідній нирці відсутня недостатність лімфовштоку. Приклад 2. Безпородній собаці під ефірно-фторотановим наркозом з нейролептаналгезією зробили бінефректомію та аутотрансплантацію лівої аутонирки на клубові судини. На 7-. 15- та 60-ту добу через черевну стінку здійснили черезшкірну біопсію зовнішньо-кортикального шару нефротрансплантату та зробили електронно-мікроскопічне дослідження ультратонких (40 нм) епонових зрізів з усіх трьох біоптатів відповідно розробленому алгоритму. Після вивчення загальної морфологічної картини експериментальних зрізів виконали фотозйомку відповідно 12-, 17-та 16-ти клітин з різних проксимальних звивистих канальшв пересадженої нирки при однаковому збільшенні - 7 000. Збільшення фотовідбитків було доведено до 15 000. За допомогою сітки Автанділова та правил точкового обліку за Глаголєвим (аналогічно до 1 прикладу^ визначили середню величину ПОВ для кожного терміну динамічного дослідження: ПОВ7=0.31; ПОВ 15-0,22: ПОВ60=0.19. Потім в кожній воборці клітин відповідних термінів дослідження розрахували загальну кількість КЛ. число яких відповідно термінам складало: 7-а доба - 9 КЛ на 12 знятих клітин; 15-а доба - 10 КЛ на 17 знятих клітин; 60-а доба - 7 КЛ на 16 знятих клітин. Коефіцієнти КЛ визначили по відношенню кількості знайдених в виборці активних лізосом до кількості досліджених клітин у відповідному терміні: КЛ7=9/12=0.78; КЛ15=10/17=0,6; КЛ60=7/16=0,44. Таким чином, оскільки на всіх термінах дослідження отримані величини ПОВ статистично значимо перевищують 0.1. а параметри КЛ достовірно більше 0,2, правомірним є висновок, шо в даному випадку має місце стійка недостатність лімфовідтоку пересадженої нирки. Для підтвердження прижиттєво встановленого діагнозу після проведення ультраметричних внутрішньовенним досліджень нефробіоптатів кетаміновим наркозом експериментальної з тварини нейролептаналгезією під зробили трансплантатнефректомію, тобто вилучення пересадженого органу для контрольних морфологічних досліджень. В просвітлених препаратах тканин нефротрансплантату, виготовлених після інтерстиційного ін'єктування синьої маси Героти у вилучену нирку, була виявлена лилятація різних сегментів внутрішньоорганого лімфатичного русла, варікозитет лімфокапілярів кортикакльної речовини, поодинокі розриви останніх з виходом барвника безпосередньо до інтерстшіію.В гістологічних препаратах, пофарбованих гематоксиліном та еозином, відмічалися зерниста та гідропічна дистрофія звивистих канальців. інтерстиціальний набряк, а також розширення просвітів лімфатичних судин поблизу аркуатних артеріол. За допомогою забарвлення сполучнотканинної строми нирки алохромним способом Ліллі були виявлені підвищена гідратація та метахромазія проміжного матриксу, підсилена його колагенізаііія. озерні накопичення гомогенної безструктурної білокподібної речовини в інтерстиції (трансформована лімфа). Таким чином, проведені контрольні морфологічні дослідження тканин експериментальної нирки підтвердтли достовірність результатів прижиттєвого визначення. Приклад 3. Світлооптично та електронномікроскопічно був досліджений нефробіоптат хворої Ю.. ЗО років, з діагнозом: хронічний гломерулонефрит, хронічна ниркова не достатність Пб ст.. Під час ультраструктурного дослідження була конкретизована морфологічна форма захворювання: хронічний мезангіокапілярний гломерулонефріт з вираженим інтерстиційним компонентом. Проявленнями останнього в ультратонкому зрізі біоптату були інфільтративно-склеротичні зміни перідуктальної строми з переважанням в інфільтратах лімфоцитів та плазматичних клітин, а також листрофічні та локальні субатрофічні зміни канальцевої системи. Для оцінки стану інтраренального лімфообігу в досліджуваній нирці в межах зрізу, який вивчали, зробили знімки 14-ти цілих каймистих клітин з делількох проксимальних звивистих канальців при збільшенні 5 000. Ультраметричні розрахунки були зроблені на фотознімках тубулоцитів. надрукованих при кінцевому збільшенні 15 000. Аналогічно до прикладів 1-2 на всіх електроннограмах методом точкового обліку визначили ПОВ цитоплазми, обчислюючи на їх підставі величину середнього ПОВ в каймистих клітинах експериментальної нирки, яка складала 0,28. Потім підрахували загальну кількість КЛ цитоплазми на всіх 14-ти знятих клітинах: їх було 7. За величиною відношення останнього до числа досліджених тубулоцитів визначили коефіцієнт КЛ. який складав 0.5. На підставі одержаних даних, оскільки ПОВ більше 0,1. а КЛ перевищує 0,2. в нефрітично зміненій нирці визначена недостатність інтраренального лімфообігу. зумовлена інфільтративно-склеротичними змінами строми та редукцією лімфомікропиркуляторного русла. Приклад 4. Реципієнту Д., 37 років, з діагнозом хронічний гломерулонефрит, термінальна ниркова недостатність, пролонгована гемодіалізом, на 15-ту добу після стандартної гетеротопічної алотрансплантації проведена черезшкірна пункпійна біопсія зовнішньо-кортикального шару нефротрансплантату. Проведено електронно-мікроскопічне дослідження ультратонких (40 нм) епонових зрізів біоптату. Після вивчення загальної морфологічної картини експериментальних зрізів були зроблені фотознімки 19 клітин з різних проксимальних звивистих канальців нефротрансплантату при стандартному збільшенні - 7 000, з наступним збільшенням фотовідбитків до 15000. Подібно наведеним s више прикладам на всіх електроннограмах визначили середню величину ПОВ цитоплазми, яка склала 0.41. Потім у виборці клітин дослідження підрахували загальну кількість КЛ цитоплазми та розрахували коефіцієнт КЛ, який складав 0.71. Оскільки отримана величина ПОВ статистично значимо перевищує 0.1. а параметри КЛ достовірно більше 0.2. в стандартно пересадженій нирці має місце недостатність лімфовідтоку. Спосіб дозволяє підвищити точність прижиттєвого визначення порушень лімфовідтоку на малому обсязі ниркової тканини. Винахід доцільно використовувати в трансплантологи та нефрології для діагностики інтраренального лімфостазу та дослідження патогенетичних механізмів різних нефропатій. —— —— — — ~ ~~ " ~~~ ПЕРЕЛІК ВИКОРИСТАНИХ АНАЛОГІВ; 1. Выренков Ю.Е., Зербино Д.Д.. Фиськова Л.Б.. Щербаков B.C. Патоморфология микролимфоциркуляторного русла почек и регионарных лимфоузлов при экспериментальном гидронефрозе//Урол. и нефрол..-1982.-№1.-С.20-28. 2. Выренков Ю.Е.. Камараули Г.Л., Демидов А.Т. Изменения интраорганного лимфатическо го русла почки после ее трансплантации//Урол. и нефрол..-1980.-№4.- С.57-62. 3. Зербино Д.Д. Общая патология лимфатической системы.-Киев Здоровье. 1974.-160с. 4. Еремин ГА.. Сперанский Н.Н.7 Василенко В.А. Морфофункциональные изменения почек при перерезке их отводящих лимфатических сосудов// Экспериментальная и клиническая оценка эффективности хирургического лечения почечной недостаточности.-Иваново,1984Вып.56.-С.62-71. -прототип.