Спосіб визначення сироваткових імуноглобулінів g, a, m людини

Спосіб визначення сироваткових імуноглобулінів G, А, М, що включає приготування основи для розчинення в ній агарового гелю, змішування гелю з антисироваткою, вирізання лунок в гелі, 3 34330 Основні етапи простої радіальної імунодифузії полягають в наступному: Готують медінал - вероналовий буфер з рН 8.6 - основу для агарового гелю. Розчиняють агар в медінал - вероналовому буфері. Змішують агар з антиси-роваткою (при t +56°С). Заливають чашки Петрі сумішшю агар антисироватка. Вирізають лунки в гелі. Вносять антиген. Відбувається імунодифузія з утворенням кілець преципітації в агаровому гелі. Відмивають. Висушують. Оцінюють преципітат. Підраховують кількість імуноглобулінів по калібровочних графіках відносно контрольної сироватки людини з відомими концентраціями імуноглобулінів G, А, М. Суттєвим в даному випадку є приготування медінал-вероналового буферу (основи агарового гелю): для отримання 500мл буферу використовують - 1,38г. вероналу: 5.5 - диетилбарбітурової кислоти, порошку погано розчинному у воді і 8,76г. медіналу: 5.5 - диетилбарбітурату натрію, добре розчинному у воді. Готують його так: 1. Підігрівають 200мл дистильованої води і розчиняють медінал. 2. Додають 200мл дистиляту. 3. Висипають веронал. 4. Підігрівають його до повного розчинення. 5. Залишають все на добу. 6. Через 24 години доводять буфер до мітки 500мл. 7. Отримують медінал - вероналовий буфер з рН 8,6 (основу для агарового гелю). Власне складники буфер у ( основи агарового гелю ) спричинили проблему: в зв’язку з зростанням наркозалежних людей в Україні практично стало неможливим отримати його інгредієнти : барбітурати (медінал і веронал). Задачею винаходу є вдосконалення способу визначення імуноглобулінів G, А, М шляхом введення нових інгредієнтів при приготуванні буферу чи пошуку нової основи для агарового гелю, що дозволить захистити дослідника від шкідливих речовин; зробить більш дешевшим і зменшить час проведення тесту. Отже, перед нами виникло завдання замінити медінал - вероналовий буфер (основу для агарового гелю ) на інший, більш доступний буфер або ж більш екологічно чисту основу, на якій можна приготувати агаровий гель: оскільки невеликі відхилення рН основи, на якій готують агаровий гель, не впливають на процес імунодифузії. Поставлене завдання вирішується завдяки тому, що у способі визначення сироваткових імуноглобулінів G, А, М, який включає в себе приготування основи для розчинення в ній агарового гелю, змішування гелю з антисироваткою, вирізання лунок в гелі, внесення антигену, проведення імунодифузії з отриманням кілець преципітації в агаровому гелі, оцінку преципітата і підрахунок кількості імуноглобулінів по калібровочних графіках, відносно контрольної сироватки людини з відомими концентраціями трьох імуноглобулінів G, А, М ; згідно з винаходом, як основу для приготування агарового гелю використовують боратний буфер з рН 8.4 і з вмістом тетраборату натрію (бури) і борної кислоти. Інколи як основу для агарового гелю 4 використовують дистильовану воду, в якій розчиняють агар. Введення нових компонентів, на якому готують агаровий гель: бури і борної кислоти (боратний буфер) або ж просто дистильованої води дозволяє економити кошти: бура, борна кислота і дистильована вода коштують набагато дешевше, ніж медінал і веронал; зменшити затрати часу на приготування буферу: компоненти боратного буферу розчиняються краще, швидше, а на дистиляті зразу ж можна готувати агаровий гель; заміна будь - якого буферу (основи для агарового гелю) тільки на дистильовану воду дає можливість працювати в більш екологічно чистій обстановці, оскільки медінал, веронал відносяться до сенсибілізуючих речовин, а бура і борна кислота - до малотоксичних речовин, які навіть при зберіганні в сухому стані здатні випаровуватись і при постійній дії на організм людини здатні підвищувати виділення амінокислот з організму, а також підвищувати активність холінестерази в крові. Згідно з винаходом, підбір основи, на якій готують агаровий гель здійснюється за допомогою речовин: бури і борної кислоти, і при проведенні тесту ми отримуємо боратний буфер: з рН 8.4, на основі якого ми готуємо агар і при внесенні в який, антисироватки і антигену, вони дифундують і утворюють кільця преципітації, які є такого ж діаметру якого були б при медінал - вероналовому буфері з рН 8,6; або ж дистильовананої води, на основі якої ми готуємо агар, і при проведенні дослідження отримуємо кільця преципітації, які є такого ж самого діаметру якого були б при медінал - вероналовому буфері з рН 8,6 і боратному буфері з рН 8.4. Отже, визначення сироваткових імуноглобулінів G, А, М ми проводимо за методом радіальної імунодифузії по Манчіні, в якій змінюємо тільки перший етап (основу для агарового гелю): медінал - вероналовий буфер замінюємо на боратний буфер або ж на дистильовану воду. Приклад 1. Готують медінал - вероналовий буфер (основу для агарового гелю): 1. Підігрівають 200мл дистильованої води і розчиняють медінал. 2. Додають 200мл дистиляту. 3. Висипають веронал. 4. Підігрівають його до повного розчинення. 5. Залишають все на добу. 6. Через 24 години доводять буфер до мітки 500мл. 7. Отримують медінал - вероналовий буфер з рН 8,6. Боратний буфер (основу для агарового гелю) отримують таким чином: 1. Розчиняють 1г борної кислоти в 250мл дистильованої води (1,24% розчин борної кислоти). 2. Розчиняють 1,9г бури в 100мл дистильованої води (1,9% розчин бури). 3. Змішують 110мл 1,24% розчин борної кислоти і 90мл 1,9% розчин бури. 4. Одержують боратний буфер. 5. Розводять боратний буфер в 2 рази (робочий розчин). 5 34330 Для пояснення суті нововведення та його переваг над прототипом проведено наступний експеримент (лабораторне дослідження): 1. Готують медінал - вероналовий буфер (основу для агарового гелю). 2. Зважують 2 грами агару. 3. В вогнестійку колбу вливають 100мл медінал - вероналового буферу. 4. Ставлять колбу на водяну баню. 5. Доводять буфер до кипіння. 6. Забирають з водяної бані. 7. Додають 2гр агару і розмішують. 8. Ставлять колбу на водяну баню до повного розчинення агару. 9. Розливають агаровий гель в пробірки Васермана. 11. Готують боратний буфер (основу для агарового гелю). 12. Розчиняють в ньому агар. (Способи приготування двох буферів – основ для розчинення агару, наведено вище). 13. Розводять стандартну сировотку в 4 рази методом „перекатки": відкривають ампулу зі стандартом; додають до неї 1мл фізіологічного розчину і розчиняють; беруть чотири пластмасові пробірки і підписують; в пробірку №1 виливають вміст ампули зі стандартною сироваткою; в пробірки №2, №3, №4 дозатором додають по 0,5мл фізіологічного розчину; в пробірку №2 дозатором відбирають 0,5мл розведеного стандарту з першої пробірки добре перемішують; в пробірку №3 відбирають 0,5мл суміші з другої пробірки, перемішують; в пробірку №4 відбирають 0,5мл суміші з третьої пробірки, перемішують; з четвертої пробірки відбирають 0,5мл суміші і виливають. 14. Розводять антисироватки проти Ig G, IgA, Ig M: відкривають 3 ампули з антисироватками; додають в кожну по 1мл фізіологічного розчину і розчиняють. 15. Беруть три інсулінові шприци. 16. В перший набирають 0,6мл антисироватки проти Ig G. 17. В другий – 0,6мл антисироватки проти IgA. 18. В третій – 0,6мл антисироватки проти Ig M. 19. Беруть шість чашок Петрі. 20. Підписують відповідно: G1, А1, МІ - в ці чашки вносять агаровий гель, розчинений в медінал - вероналовому буфері. 21. В чашки Петрі з написами G2, А2 , М2 вносять гель, приготований на боратному буфері. 22. Беруть три пробірки з агаровим гелем, приготованому на медінал вероналовому буфері. 23. Розігрівають на водяній бані до повного розчинення. 24. Охолоджують до +56°С. 25. В першу пробірку з агаром додають 0,3мл антисироватки проти Ig G. 6 26. В чашку Петрі (G1) виливають вміст першої пробірки і ставлять на рівну поверхню для рівномірного розподілу гелю. 27. В другу пробірку з агаровим гелем - 0,3мл антисироватки проти Ig A. 28. В чашку Петрі (А1) виливають вміст другої пробірки і ставлять на рівну поверхню. 29. В третю пробірку з агаровим гелем – 0,3мл антисироватки проти Ig M. 30. В чашку Петрі (М1) виливають вміст третьої пробірки і ставлять на рівну поверхню для рівномірного розподілу гелю. 31. Всі три чашки кладуть на 40хв в холодильник. 32. Беруть три пробірки з агаровим гелем, приготованому на боратному буфері. 33. Розігрівають на водяній бані до повного розчинення. 34. Охолоджують розігрітий агар на медіналовому буфері до +56°С. 35. В першу пробірку з агаром додають 0,3мл антисироватки проти Ig G. 36. В чашку Петрі (G2) виливають вміст першої пробірки і ставлять на рівну поверхню для рівномірного розподілу гелю. 37. В другу – 0,3мл антисироватки проти Ig A. 38. В чашку Петрі (А2) виливають вміст другої пробірки і ставлять на рівну поверхню. 39. В третю – 0,3мл антисироватки проти Ig M. 40. В чашку Петрі (М2) виливають вміст третьої пробірки і ставлять на рівну поверхню для рівномірного розподілу гелю. 41. Всі три чашки кладуть на 40хв в холодильник. 42. Виймають всі шість чашок з холодильника. 43. В кожній чашці в агаровому гелі пробійником роблять по 19 лунок. 44. В чотири верхні лунки дозатором по 0,2мкл розкапують стандартну сироватку відповідно : в першу - цільну; в другу - розведену в двічі; в третю - в тричі; в че тверту - в чотири рази. 45. Беруть 15 досліджувальних сироваток хворих. 46. В кожну з шести чашок відповідно, по черзі розкапують кожну досліджу-вальну сироватку хворого по 0,2мкл. 47. Всі шість чашок ставлять в вологі камери. 48. Проводять імунодифузію одночасно на агарах, розчинених на різних буфера х (основах). 49. Через добу беруть чашки Петрі з вологих камер і заливають оцтовою кислотою. 50. Через 5хв зливають оцет і промивають чашки Петрі водою. 51. Отримують в чашках Петрі: G1 і G2, А1 і А2, М1 і М2 одинакові за розмірами кільця преципітації (див. фото 1, 2, 3). 52. Знімають прозорою лінійкою діаметр кілець i записують в журнал (див. табл.). 53. Підносять діаметр кілець преципітації до квадрату. 54. По трьох калібровочних кривих: відповідної для кожного імуноглобуліна, знаходять рівень трьох сироваткових Імуноглобулінів G, А, М для кожного хворого. Приклад 2. 7 34330 Для пояснення суті нововведення та його переваг і для підтвердження теоретичної заміни практикою, ми провели з дослідженням, вказаним вище, параралельно ще один експеримент, окрім агарів, розчинених в медінал - вероналовому буфері і боратному буфері: одночасно провели імунодифузію на агаровому гелі, приготованому на новій основі - дистильованій воді. І в кінцевому підсумку отримали одинакові преципітати в агарових гелях, приготованих на трьох різних основах: на медінал - вероналовому буфері, на боратному буфері і на дистильованій воді. Суть винаходу пояснюється в таблиці і на фотографіях, де зображені: в табл. - кільця преципітації Ig G і Ig А, отримані в агарових гелях, приготованих на трьох різних основах: медінал - вероналовому буфері, на боратному буфері і на дистильованій воді. на фото 1 - чашка Петрі зліва : кільця преципітації Ig G, які утворились в агарі, розчиненому на медінал - вероналовому буфері; 8 - чашка Петрi справа : кільця преципітації Ig G. які утворились в агарі, розчиненому на боратному буфері. на фото 2 - ча шка Петрі зліва: кільця преципітації Ig G в а гаровому гелі, приготованому на дистиляті; справа чашка Петрі з преципітатами Ig G, які утворились в агаровому гелі, розчиненому в боратному буфері. на фото 3 - кільця преципітації Ig А, утворені в агарових гелях, приготованих на трьох основах (зліва на право): на медінал - вероналовому буфері, на боратному буфері і на дистильованій воді. Спосіб здійснюється таким чином: заміною медінал – вероналового буферу, на основі якого готують агаровий гель, на боратний або на дистильовану воду, яка дозволяє зробити дослідження екологічно чистішим і безпечнішим. Таблиця Результати експеременту: кільця преципітації Ig G і Ig A, отримані на трьох різних основах Порядкові номери стандартних сироваток і сироваток хворих 1 (St) 1\2 (St) 1\4 (St) 1\8 (St) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Діаметри кілець Діаметри кіДіаметри кі- Діаметри кілець преципітації IgG лець преципі- лець преципі- преципітації IgA 1 отриманих в тації IgG 2 тації IgG 3, 1, отриманих в агаровому гелі, отриманих в отриманих в агаровому гелі, розчиненому в агаровому гелі, агаровому гелі, розчиненому в медінал – веро- розчиненому в розчиненому в медінал – вероналовому бу- боратному бу- дистильованій наловому буфері (мм) фері (мм) воді (мм) фері (мм) 10,80 9,50 8,80 7,90 10,80 9,60 8,50 9,50 9,00 9,00 9,20 9,70 9,50 9,50 9,50 9,50 8,80 8,50 10,60 10,80 9,50 8,80 7,90 10,80 9,60 8,50 9,50 9,00 9,00 9,20 9,70 9,50 9,50 9,50 9,50 8,80 8,50 10,60 10,80 9,50 8,80 7,90 10,80 9,60 8,50 9,50 9,00 9,00 9,20 9,70 9,50 9,50 9,50 9,50 8,80 8,50 10,60 8,00 7,50 6,50 5,60 8,00 7,50 6,60 8,00 5,20 8,00 5,20 7,50 7,50 8,00 8,00 8,00 5,60 7,50 6,50 Діаметри кілець преципітації IgA 2, отриманих в агаровому гелі, розчиненому в боратному буфері (мм) 8,00 7,50 6,50 5,60 8,00 7,50 6,60 8,00 5,20 8,00 5,20 7,50 7,50 8,00 8,00 8,00 5,60 7,50 6,50 Діаметри кілець преципітації IgA 3, отриманих в агаровому гелі, розчиненому в дистильованій воді (мм) 8,00 7,50 6,50 5,60 8,00 7,50 6,60 8,00 5,20 8,00 5,20 7,50 7,50 8,00 8,00 8,00 5,60 7,50 6,50 9 Комп’ютерна в ерстка О. Рябко 34330 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601