Спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі

1. Спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі, що включає послідовне одержання з одного вихідного матеріалу екстрагуванням хлороформом двох проб з вмістом речовин переважно кислотного та переважно основного характеру при попередній зміні рН середовища до значень 2,0-3,0 та 9,0-10,0 відповідно, фільтрацію хлороформних витяжок у присутності безводного натрію сульфату, упарювання та якісне визначення вилучених речовин, який відрізняє ться тим, що перед екстракцією хлоро 3 35842 Відомі способи визначення індивідуальних речовин (амлодипіну, кеторолаку) у сечі при підкислюванні проб 0,1М розчином кислоти хлористоводневої, очищенні сечі діетиловим етером та екстракції речовин після підлуговування проб хлороформом (амлодипін) або діетиловим етером (кеторолак) [1, 2]. До недоліків зазначених способів можна віднести їх придатність для аналізу лише індивідуальних речовин без урахування можливості дослідження сумішей отрут основного та кислотного характеру при комбінованих отруєннях. Відомий спосіб визначення окремих груп алкалоїдів (опіатів) речовин основного характеру (морфін, кодеїн) у сечі, який базується на підлуговуванні проб з наступним ізолюванням речовин сумішшю хлороформ-н-бутанол (9:1) та очищенням витяжок при застосуванні ТШХ-методу за умовами, розробленими з урахуванням властивостей досліджуваної групи речовин або індивідуальних отрут [3]. Спосіб може застосовуватися для визначення окремих гр уп речовин або індивідуальних отрут без урахування можливості дослідження сумішей речовин основного та кислотного характеру та характеризується відсутністю уніфікованих умов екстрагування сумішей отрут з сечі. Відомий, наприклад, спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру, який полягає в екстрагуванні з сечі речовин кислотного та нейтрального характеру діетиловим етером після підкислювання проб концентрованою кислотою хлористоводневою. Речовини основного характеру екстрагуються хлороформом після підлуговування сечі. Очищення витяжок проводиться фільтрацією, для висушування органічного шару застосовується безводний натрію сульфат [4]. До недоліків способу можна віднести застосування різних органічних розчинників для речовин основного та кислотного характеру, а також відсутність ефективного очищення, що обумовлює наявність значного фону домішок та його впливу на результати дослідження. В якості прототипу вибрано спосіб визначення слабкоосновної речовини - кофеїну, який полягає у одержанні проби 20мл сечі, яку підкислювали 0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-3,0 та екстрагували хлороформом (двічі по 15мл). Хлороформну фазу відокремлювали, а водну підлуговували 25% розчином аміаку до рН 9,0-10,0 і знову екстрагували хлороформом (двічі по 15мл). Хлороформну фаз у відокремлювали. Обидві хлороформні витяжки об’єднували, фільтрували через паперовий фільтр з безводним натрію сульфатом та упарювали. Залишок промивали гексаном (тричі по 10мл) для усунення впливу домішок, висушували та розчиняли у відповідному розчиннику. Наявність кофеїну у пробі визначали за методом ТШХ [5]. Проте відомий спосіб призначений для аналізу індивідуальної речовини слабкоосновного характеру без урахування можливості аналізу комбінованих отруєнь, проведення скринінгу при неспрямованному дослідженні. 4 Відомі способи проведення скринінгових досліджень сечі для речовин лише основного характеру із застосуванням іонних асоціатів, що передбачають утворення іонних асоціатів з кислотним індикатором при створенні оптимального значення рН середовища, яке забезпечує утворення максимальної кількості іонних асоціатів. Для створення рН середовища використовують буферний розчин, який забезпечує стійкість іонних асоціатів. В якості оптимального екстрагента іонних асоціатів застосовують хлороформ, який активно витискає молекули води з гідратних оболонок іонів, що сприяє стійкості іонних асоціатів. При наявності забарвлення хлороформного шару виконували дослідження методом ВЕРХ або ГРХ для подальшого розділення отрут на гр упи [6-8]. Недоліками наведених скринінгових досліджень є обмеженність аналізу у зв’язку з дослідженнями лише речовин основного характеру. Завдання корисної моделі полягає у створенні способу визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі шляхом послідовного одержання окремих проб з вмістом речовин основного та кислотного характеру з однієї попередньо очищеної порції вихідного матеріалу, розділення речовин на групи в залежності від їх здатності утворювати іонні асоціати з кислотними індикаторами, що надає можливість використовувати заявлений спосіб для скринінгових досліджень, а також для визначення у сечі лікарських речовин основного та кислотного характеру, як у сумішах отрут, так і індивідуально. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі, що включає послідовне одержання з одного вихідного матеріалу екстрагуванням хлороформом двох проб з вмістом речовин переважно основного та переважно кислотного характеру при попередній зміні рН середовища до значень 2,0-3,0 та 9,0-10,0 відповідно, фільтрацію хлороформних витяжок у присутності безводного натрію сульфату, упарювання та якісне визначення вилучених речовин. Корисною моделлю передбачено, що перед екстракцією хлороформом здійснюють очищення підкисленого до рН 2,0-3,0 вихідного матеріалу шляхом екстрагування домішок гексаном та відокремлення гексанової фази, а скринінг речовин кожної з одержаних проб здійснюють за їх здатністю утворювати іонні асоціати з метиловим оранжевим у суміші з ацетатним буферним розчином та хлороформом з подальшим якісним визначенням речовин переважно основного та переважно кислотного харктеру у порівнянні з групами стандартних лікарських речовин, здатних/нездатних утворювати іонні асоціати за аналогічних умов. Згідно з корисною моделлю якісне визначення речовин у пробах здійснюють будь-яким придатним, зокрема хроматографічним методом, переважно високоефективної рідинної хроматографії, з подальшим підтвердженням наявності речовин, що аналізуються, за ультрафіолетовим спектром. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Необхідну порцію сечі підкислюють 0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,0-3,0 та 5 35842 принаймні двічі екстрагують гексаном. Гексанові витяжки з розчиненими в них домішками відкидають. Кислий водний шар (рН 2,0-3,0) екстрагують хлороформом принаймні двічі. Хлороформні витяжки з речовинами кислотного характеру фільтрують через паперовий фільтр з 0,5-1,0г безводного натрію сульфату та упарюють досуху. Для екстракції хлороформом речовин основного характеру після розділення фаз та відокремлення хлороформної витяжки з речовинами кислотного характеру водний шар підлуговують 25% розчином аміаку до рН 9,0-10,0 та знову екстрагують хлороформом принаймні двічі. Одержану хлороформну витяжку з речовинами основного характеру фільтрують через паперовий фільтр з 0,5-1,0г безводного натрію сульфату та упарюють досуху. Для скринінгових досліджень застосовують уніфіковані умови утворення іонних асоціатів з метиловим оранжевим для розділення речовин на відповідні групи. Визначення речовин основного та кислотного характеру в одержаних пробах проводять методами високоефективної рідинної хроматографії та/або газо-рідинної хроматографії та/або УФспектрофотометрії та/або екстракційної фотометрії у порівнянні за стандартними лікарськими засобами, поділеними на групи, що утворюють або не утворюють іонні асоціати за аналогічних умов, наведених у способі. Корисна модель ілюструється прикладом. Приклад 1. Експериментальним шляхом вивчено можливість застосування заявленого способу при скринінгових дослідженнях лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі. 20мл сечі з вмістом речовин основного та кислотного характеру залишали на 24 години при кімнатній температурі, після чого одержували проби з вмістом речовин переважно кислотного та переважно основного характеру за заявленим способом. Порцію вихідного матеріалу (сечі) підкислили 0,1М розчином кислоти хлористоводневої до рН 2,5 і двічі екстрагували по 10мл гексаном. Після розділення фаз гексанові витяжки відкидали. Відокремлену водну фазу екстрагували двічі по 10мл хлороформом. Відділяли хлороформні витяжки з вмістом речовин переважно кислотного характеру, фільтрували через паперовий фільтр з 1,0г безводного натрію сульфату і упарювали досуху. Одержали пробу для визначення речовин кислотного характеру. Водну фазу, що залишилася після вилучення речовин кислотного характеру, підлуговували 25% розчином аміаку до рН 9,5 і знову екстрагували двічі хлороформом порціями по 10мл. Відокремлені хлороформні витяжки з вмістом речовин переважно основного характеру, фільтр ували через паперовий фільтр з 1,0г безводного натрію сульфату і упарювали досуху. Одержали пробу для визначення речовин основного характеру. Обидві сухі проби паралельно розчиняли відповідно у двох порціях по 2мл хлороформу. Для утворення іонних асоціатів в ділильні лійки вноси 6 ли 5мл ацетатного буферного розчину (рН 4,6); 1мл досліджуваного розчину; 5мл 0,1% розчину метилового оранжевого та 10мл хлороформа. Ділильні лійки збовтували 5хв та відстоювали 5хв для розділення фаз. При утворенні речовинами, що містяться у пробі, іонних асоціатів з метиловим оранжевим хлороформний шар набував жовтого забарвлення. У випадку, коли іонні асоціати не утворюються забарвлення хлороформного шару відсутнє. Хлороформний шар випаровували і залишок розчиняли у відповідному розчиннику. Для подальшого визначення речовин у пробах використовували різні методи хроматографування, зокрема ВЕРХ (розчинник ацетонітрил) та ГРХ (розчинник ацетон). Скринінг речовин у пробах здійснювали наступним чином. Речовини основного і кислотного характеру, що утворювали або не утворювали іонні асоціати, порівнювали з групами відомих стандартних лікарських препаратів з аналогічними властивостями (основний чи кислотний характер, здатність утворювати або не утворювати іонні асоціати з метиловим оранжевим). У результаті проведених авторами досліджень було визначено наступне. У хлороформних витяжках, отриманих з водного шару при рН 2,0-3,0 утворюють іонні асоціати з метиловим оранжевим за заявленим способом - аміназин, дипразин, тізерцин, димедрол, промедол, циклодол; не утворюють іонні асоціати - барбітал етамінал, барбаміл, фенобарбітал, кофеїн, теофілін, теобромін, пентоксифілін. У хлороформних витяжках, отриманих з водного шару при рН 9,0-10,0 утворюють іонні асоціати з метиловим оранжевим за заявленим способом - аміназин, дипразин, тізерцин, димедрол, промедол, циклодол, анабазин, атропін, клофелін, кодеїн, кокаїн, лідокаїн, прокаїн, папаверин, фентаніл, хінін; не утворюють іонні асоціати - кофеїн, теофілін, теобромін, пентоксифілін, морфін, 4монометиламіноантипірин, ксантинол, атенолол. Таким чином, заявлений спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі надає можливість проведення скринінгових досліджень та отримування надійних і відтворюваних результатів при аналізі сумішей речовин різного характеру. Заявлений спосіб визначення лікарських речовин основного та кислотного характеру у сечі характеризується перевагами перед ВЕРХскринінгом речовин, що обумовлено значним скороченням часу пошуку о трут в залежності від їх здатності утворювати іонні асоціати та можливості проведення ідентифікації лікарських речовин основного та кислотного характеру за відносним часом утримування при застосуванні індикатора як загального внутрішнього стандарту для усі х досліджуваних речовин. Спосіб може бути застосований у роботі контрольно-аналітичних та хіміко-токсикологічних лабораторій. Джерела інформації 1. Бондар Н.М. Дослідження умов екстракції амлодипіну з водних розчинів органічними розчинниками та його аналіз в біологічних рідинах органі 7 35842 зму/ Н.М. Бондар, B.C. Бондар, О.О. Маміна// Запорожский мед. журн. - 2004. - №5. - С.146-149. 2. Бондар B.C. Дослідження методів виділення кеторолаку з об’єктів біологічного походження// B.C. Бондар, О.В. Болотова// Вісник фармації. 2005. - №2. - С.13-15. 3. Горбачева Н.А., Орлова A.M. Применение ТСХ-анализа при судебно-химическом исследовании мочи на опиаты// Н.А. Горбачева, A.M. Орлова// С удебно-мед. экспертиза. - 2003. - №3 - С.3438. 4. Еремин С.К. Анализ наркотических средств// С.К. Еремин, Б.Н. Изотов, Н.В. Веселовская -М.: Мысль, 1993. - 259с. 5. Мамина Е.А. Определение кофеина методом ВЭЖХ в биологических жидкостях при совместном присутствии с другими производными пури Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 8 на// Е.А. Мамина, В.Ф. Перший// Хим.-фармацевт. журн. - 2002. - №4.- С.48-50. 6. Маміна О.О. Застосування методу ВЕРХ для аналізу іонних асоціатів токсичних речовин// Вісник фармації. - 2001. - №1. - С.20-24. 7. Маміна О.О. Скринінг деяких наркотичних та одурманюючих речовин основного характеру з використанням методу газо-рідинної хроматографії// О.О. Маміна, В.В. Болотов, B.C. Бондар// Фармацевт. журн. - 2002. - №1 -С.47-51. 8. Маміна О.О. Використання методу високоефективної рідинної хроматографії для ідентифікації та кількісного визначення похідних барбітурової кислоти// Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики: зб. наук. статей Запоріжжя: Вид-во ЗДМУ. - 2004. - вип.ХШ. С.226-233. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601