Штам бульбочкових бактерій bradyrhizobium japonicum 36, активний симбіотичний азотфіксатор, який підвищує урожайність сої і рекомендований для приготування бактеріальних препаратів

Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum 36, активний симбіотичний азотфіксатор, депонований в Депозитарії IMB Н АН України під №В-1798, який підвищує урожайність сої і рекомендований як основа бактеріальних препаратів. (19) (21) u200803755 (22) 25.03.2008 (24) 10.11.2008 (46) 10.11.2008, Бюл.№ 21, 2008 р. (72) ТОЛКАЧОВ МИКОЛА ЗАХАРОВИЧ, U A, ДІДОВИЧ СВІТЛАН А ВІТАЛІЇВНА, U A, АБДУРАШИТОВ СУЛЕЙМАН ФЕВЗІЙОВИЧ, U A 3 36700 ми сучасних сортів, становить в фазі цвітіння 2,550,0мкМоль етилену/рослину за годину.Технічним результатом корисної моделі є підвищення ефективності штаму бульбочкових бактерій сої, його адаптаційних властивостей та можливість використання його як альтернативного штаму замість виробничого штаму М-8 в мікробних препаратах для передпосівної обробки насіння сої з метою підвищення урожайності і поліпшення якості її зерна. Недоліком, що перешкоджає досягненню очікуваного технічного результату при використанні штаму Bradyrhizobium japonicum М-8, є наступна обставина. На сьогоднішній день висококонкурентоздатний, ефективний в симбіозі з сучасними сортами сої і високотехнологічний штам Bradyrhizobium japonicum М-8 використовується як основа мікробіологічного препарату Ризобофіту (ТУ У 319.00494456-006-2000), проте, відомо, що штами ризобій можуть втрачати нодулюючу здатність, тому виникає необхідність отримання штаму-дублер у, спроможного замінити виробничий штам в мікробних препаратах, що застосовуються для передпосівної обробки сучасних сортів для підвищення її продуктивності. В основу корисної моделі поставлена задача одержання штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum, адаптованого до грунтово-кліматичних умов півдня України і сортів сої, які там вирощують, спроможного ефективно зв'язувати азот атмосфери в симбіозі з рослинами і підвищувати урожайність зерна сої. Поставлена задача вирішена шляхом виділення у 1997 році з бульбочок сої сорту Юг-40, інокульованого ґрунтовою суспензією, штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum 36, активного симбіотичного азотфіксатора, який підвищує урожайність сої і може бути рекомендованим для приготування бактеріальних препаратів. Виділений шляхом аналітичної селекції штам Bradyrhizobium japonicum 36 має такі властивості, які переважно співпадають з властивостями штаму-аналогу: клітини 5-10-добової культури у штамів Bradyrhizobium japonicum 36 і Bradyrhizobium japonicum M-8 рухомі завдяки полярному джгутику (монотрихи) і мають паличковидну форму. Розмір клітин штаму Bradyrhizobium japonicum 36 становить 0,3x1,2мкм. Ріст бактерій даних штамів при посіві штрихом на агаризованому гороховому середовищі з глюкозою або манітом слабкий, штрих білуватий, слизистий. Колонії клітин однотипні, круглі з чітким контуром, опуклі, білі, блискучі, слизуваті, діаметром до 1,0мм у штаму Bradyrhi zobium japonicum 36 з'являються на 7-8 добу. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 і штам-аналог молоко з лакмусом підлужують, не пептонізують, желатин не розріджують, на середовищах з органічним азотом (МПА) не ростуть. Оптимальна температура для росту і розмноження даних штамів 25-28°С, вони стабільно зберігаються на гороховому агаризованому середовищі при температурі +4°С з терміном наступного пересіву через 6 місяців. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 утворює активні бульбочки з всіма сортами сої, що вирощу 4 ють в Україні, і сортозразками дикої сої. На квасолі і люцерні штам бульбочок не утворює. В 2003 році в польовому досліді на темнокаштановому ґрунті без зрошення (достатня кількість вологи була відмічена тільки у червні-серпні місяці) в Інституті землеробства Південного регіону УААН штам Bradyrhizobium japonicum 36 в симбіозі з соєю сорту Юг-30 за ефективністю азотфіксації був на рівні штаму Bradyrhizobium japonicum M-8. Нітрагінізація на фоні інтродукованої ґрунтової популяції ризобій сої підвищила кількість кореневих бульбочок на 3,7-5,7 одиниць/рослину (6193,4%). Виявлена тенденція до зростання урожайності зерна сої під впливом штаму Bradyrhizobium japonicum 36 на 1,7ц/га (9,5%). Зазначена вище сукупність суттєви х ознак штаму Bradyrhi zobium japonicum 36 підтверджує можливість очікуваного технічного результату. Характеристика штаму бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum 36. Номенклатурні дані: рід - Bradyrhizobium, вид - Bradyrhizobium japonicum, депонований в Депозитарії ІMB НАН України під №В-1798. Походження штаму. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 було отримано в 1997 році в Південній дослідній станції Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН з бульбочок сої сорту Юг40, інокульованої ґрунтовою суспензією. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 первісно був позначений в колекції ПДС ІСГМ УААН і наданий для польових досліджень в наукові установи України під №46, але, для запобігання повторення вже існуючого такого ж номеру іншого штаму бульбочкових бактерій сої, з 2007 року номер виділеного штаму було змінено на 36, під яким цей штам і було направлено на реєстрацію в Депозитарій ІMB НАН України. Спосіб виділення. Штам виділений методом аналітичної селекції із свіжих бульбочок сої, вирощеної на вермикуліті у теплиці ПДС ІСГМ УААН, Толкачовим М.З. в 1997 році і ідентифікований Дідович С.В. за визначником Бергі 1984 року, методичним рекомендаціям ІСГМ РАСГН [Возняковская Ю.М., Попова Ж.П. Методические рекомендации по идентификации неспоровых бактерий, доминирующих в ризосфере растений - Л., 1985. 48с.] і порівняний з типовим штамом Bradyrhizobium japonicum M-8, депонованим в Депозитарії ІMB Н АН України під №В-7198. Біотехнологічна характеристика. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 утворює активні азотфіксувальні бульбочки на коренях різноманітних сортів сої і сортозразків дикої сої та завдяки наявності ферменту нітрогенази в симбіозі з рослинами фіксує азот атмосфери, що підвищує продуктивність сої. Нітрогеназна активність, яка визначалася ацетиленовим методом на газовому хроматографі “Chrom-5” з полум'яно-іонізаційним детектором, у фазі цвітіння рослин становила від 2,0 до 50,0мкМоль етилену/рослину за годину. Морфолого-культуральні і фізіолого-біохімічні ознаки штаму Brad yrhizobium japonicum 36. Клітини 5-10-добової культури мають паличковидну форму розміром 0,3мкм в ширину і 1,2мкм в довжину, рухомі завдяки полярному джгутику (монотрих). 5 36700 Штам грамнегативний, спор не утворює, облігатний аероб. Ріст бактерій при посіві штрихом на агаризованому гороховому середовищі з глюкозою або манітом слабкий, штрих білуватий, слизистий. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 відноситься до повільноростучи х бульбочкових бактерій, колонії штаму - блискучі, слизисті, з'являються на поверхні агару на 7-8 добу, мають округлу до 1мм в діаметрі і випуклу форму. Біля колоній на поверхні агару часто утворюється райдужний ореол, флюоресцуючих та феназинових пігментів штам не утворює. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 на середовища х з органічним азотом (МПА) не росте, але на поживних субстратах з солями амонію добре розвивається. Штам активно засвоює глюкозу, фр уктозу, галактозу, мальтозу, маніт, дульцит. Відсутність ферменту інвертази не дає можливості засвоювати сахарозу. Штам має гідрогеназу і частково реутилізує енергію водню, який виділяється при симбіотичній азотфіксації в бульбочках сої. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 характеризується денітрифікуючою здатністю (відновлює нітрати до молекулярного азоту), уреазною і каталазною активністю. Штам не має протеолітичної активності (не розріджує желатин), амілазної активності (не гідролізує крохмаль), не виявляє оксидазної активності. При культивуванні на лакмусову знежиреному молоці підлужує середовище, молоко не пептонізує. Штам добре розвивається на картопляній скибочці і утворює слизистий наліт білуватого кольору. Температурний інтервал росту штаму Bradyrhizobium japonicum 36 складає 18-37°С, а температурний оптимум - 25-28°С. Ріст бактерій 6 спостерігається в діапазоні рН 4,5-8,5, оптимум рН 6,5-7,5. Ознаки штаму стійкі. Культуру зберігають на манітно-дріжджовому агарі або на бобовому агарі з манітом чи глюкозою при температурі 4-5°С і пересівають один раз в 6 місяців. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 утворює активні бульбочки з всіма сортами сої, що вирощують в Україні, і сортозразками дикої сої. На квасолі і люцерні бульбочок не утворює. Штам Bradyrhizobium japonicum 36 рекомендується як основа для виготовлення мікробних препаратів під сою, в тому числі Ризобофіту. Обробку насіння сої проводять в день посіву або невеличкими партіями безпосередньо перед посівом вручну або механізовано згідно рекомендацій застосування біопрепаратів. В 2004-2007 роках сумісно з науковими установами України в польових дослідах на чорноземах південних та звичайних досліджена ефективність нітрагінізації сучасних сортів сої штамом Bradyrhizobium japonicum 36. Виявлено, що 2004-2005 роках в умовах польових дослідів на чорноземі звичайному з ґрунтовою популяцією ризобій сої передпосівна інокуляція насіння сої сорту Аметист штамом Bradyrhizobium japonicum 36 забезпечила максимальну кількість і біомасу кореневих бульбочок, висоту рослин і площу листової поверхні, що за два роки підвищило урожайність зерна в середньому на 2,5ц/га (15,0%) порівняно до контролю без інокуляції і на 1,4ц/га (7,9%) порівняно до варіанту з інокуляцією виробничим штамом М-8 (табл. 1). Таблиця 1. Ефективність нітрагінізації сої сорту Аметист штамами Bradyrhizobium japonicum (польові досліди на чорноземі звичайному, Інститут зернового господарства УААН, середнє за 2004-2005pp.) Варіант досліду Контроль - без інокуляції Виробничий штам М8 Перспективний штам 36 НІР05 2004р. 2005р. Висота рослини, см Кількість буБіомаса бульбо- Площа листової льбочок, оди- чок, мг/рослину поверхні, тисяч ниць/рослину м 2/га Фаза цвітіння - налив бобів Урожайність зерна, ц/га 73 7,6 660 37,9 16,7 74 21,5 1230 41,6 17,8 81 34,0 1490 44,8 19,2 0,74 1,27 В 2005-2006 роках в умовах польових дослідів на чорноземі південному передпосівна інокуляція насіння сої сорту Деймос штамом Bradyrhizobium japonicum 36 забезпечила максимальну кількість і біомасу кореневих бульбочок, площу листової по верхні, що підвищило урожайність зерна на 4,6ц/га (32,4%) порівняно до контролю без інокуляції і на 2,0ц/га (11,9%) порівняно до варіанту з інокуляцією виробничим штамом М-8 (табл. 2). 7 36700 8 Таблиця 2. Ефективність нітрагінізації сої сорту Деймос штамами Bradyrhizobium japonicum (польові досліди на чорноземі південному, Кримський інститут АПВ, середнє за 2005-2006pp.) Варіант досліду Контроль - без інокуляції Виробничий штам М-8 Перспективний штам 36 НІР05 2005р. 2006р. Кількість бульбочок, одиниць/рослину Площа листової поверхні, тисяч м 2/га (2006р.) Фаза цвітіння рослин Біомаса бульбочок, мг/рослину Урожайність зерна, ц/га 5,0 55 35,1 14,2 23,8 38,1 1,6 8,1 745 1075 140 80 34,7 38,4 2,01 16,8 18,8 0,59 1,20 В 2006-2007 роках в польових дослідах визначена ефективність нітрагінізації двох сортів сої штамом Bradyrhizobium japonicum 36. Як свідчать дані таблиці 3 та 4, передпосівна обробка насіння сої сортів Аметист та Романтика штамом 36 за безпечила формування максимальної кількості кореневих бульбочок та їх біомаси, максимальну висоту рослин і кількість насіння на рослину порівняно до варіанту без нітрагінізації. Таблиця 3. Ефективність симбіозу сої сорту Аметист зі штамом Bradyrhizobium japonicum 36 (польові досліди, Полтавська державна аграрна академія, середнє за 2006-2007pp.) Варіант досліду Контроль - без інокуляції Перспективний штам 36 НІР05 2006р. 2007р. Кількість буль- Біомаса бульбобочок, одичок, мг/рослину ниць/рослину Фаза бутонізації - налив бобів Висота рослини, см Кількість насіння на рослині, шт. Урожайність зерна, ц/га 1,6 140 74,0 40,6 12,9 27,0 718 83,3 50,3 14,9 3,8 150 5,1 6,4 9,94 9,28 1,43 2,26 Таблиця 4. Ефективність симбіозу сої сорту Романтика зі штамом Bradyrhizobium japonicum 36 (польові досліди, Полтавська державна аграрна академія, середнє за 2006-2007pp.) Варіант досліду Контроль - без інокуляції Перспективний штам 36 НІР05 2006р. 2007р. Кількість бу- Біомаса бульбольбочок, оди- чок, мг/рослину ниць/рослину Фаза бутонізації-налив бобів Висота рослини, см Кількість насіння на рослині, шт. Урожайність зерна, ц/га 4,2 150 74,9 41,3 11,6 22,0 558 74,1 48,0 13,4 3,8 150 4,34 5,37 9,75 8,78 2,16 1,96 В результаті високоефективного симбіозу сої з перспективним штамом 36 отримано додатковий урожай сорту Аметист в розмірі 2,0ц/га (15,5%), сорту Романтика - 1,8ц/га (15,5%). Отримані дані свідчать, що штам Bradyrhizobium japonicum 36 є високоефективним в симбіозі з сучасними сортами сої перспективним штамом і може бути використаний як основа мікробних препаратів для передпосівної обробки насіння сої. 9 Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 36700 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601