Спосіб oдержання пеніциліну чи цефалоспорину

1 Способ получения пенициллина или цефалоспорина формулы (I) или (II) ISH, Н он где X обозначает S или СЬЬ, R является 6членным необязательно замещенным углеводородным кольцом, a R-i, является атомом водорода, атомом галогена, метильной группой, метоксигруппой, СгС4-алкенильной группой или метиленовой группой, связанной с органическим радикалом атомами кислорода, серы или азота, в котором 6-аминопенициллановая или 7аминоцефалоспорановая кислота формулы (IV) или (V) \ s (IV) сн, сн3 он , W в которой X и Ri имеют значения указанные выше, взаимодействует при температуре между 5 С и +35 С, в присутствии фермента пенициллинацилазы в свободной или иммобилизованной форме, с амидом формулы (III) NB, R, (Ill) О в которой R имеет значения указанные выше, R2 и R3 являются каждый независимо атомом водорода или линейной либо разветвленной С-і-Сз алкильной группой или с его солями, в молярном отношении от 1 до 6 моль указанного амида (III) на моль кислоты (IV) или (V), отличающийся тем, что в реакционную смесь добавляют ингибитор фермента формулы (VI) СИ—К, R, (VI) где R4 является линейной либо разветвленной С1-С5 алкильной группой, замещенным или незамещенньм ароматическим кольцом, галогеном, протоном, Y может отсутствовать или, в случае присутствия, являться О, S, СЬІ2, фенилом или галогеном, Rs выбирается из числа карбоксильной группы, линейных либо разветвленных С1-С4 эфиров или -CONH2 группы, R6 выбирается из Н, ОН, ОСНО или СНз, при этом ингибитор присутствует в молярной концентрации от 0,0001 до 0,5 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что молярная концентрация указанного ингибитора предпочтительно составляет от 0,0001 до 0,2 3 Способ по любому из пп 1 и 2, отличающийся тем, что указанный ингибитор (VI) выбирается из группы соединений, состоящей из фенилуксусной кислоты, феноксиуксусной кислоты, миндальной кислоты и (линейных или разветвленных) С-і-Сз амидов и эфиров этих кислот 4 Способ по любому из пп 1 и 2, отличающийся тем, что указанный амид (III) выбирается из группы соединений, содержащей D-фенилглицин и его соли с органическими или неорганическими кислотами О о 44709 Настоящее изобретение касается усовершенствованного ферментативного способа получения пенициллинов и цефалоспоринов формул I и II № К СП) в которых X обозначает S или СЬЬ, R является 6-членным необязательно замещенным углеводородным кольцом, a Ri является атомом водорода, атомом галогена, метильной группой, метоксигруппой, СгС4-алкенильной группой, или метиленовой группой, связанной с органическим радикалом атомами кислорода, серы или азота В US-A-3816253 описывается способ получения пенициллинов или цефалоспоринов путем взаимодействия а-замещенной а-аминокислоты с производным 7-аминоцефалоспорановой или 7амино-дезацетокси-цефалоспорановой кислоты в присутствии активных микроорганизмов или фермента в водном растворе, при температуре от +5°С до +50°С, предпочтительно между +20°С и +40°С Обнаружено, что при проведении процесса как описано в патенте США выход желаемого целевого продукта сильно понижен из-за сопутствующих параллельных реакций, образующих побочные продукты, которые трудно выделить из реакционной смеси В ЕР-А-0473008 предлагается метод получения пенициллинов и цефалоспоринов формулы I или II, который предназначен для того, чтобы устранить или, по крайней мере, уменьшить вышеупомянутые недостатки Согласно этому методу, 6-аминопенициллановая или 7аминоцефалоспорановая кислота взаимодействует с а-замещенной а-аминокислотой формулы RCH(NH2)-COOH или ее реакцион-носпособным производным в присутствии иммобилизованной пенициллин-ацилазы, причем реакция проводится в вэдной среде при температуре между -5°С и +20°С, и предпочтительно при температуре около +4°С Условия реакции ясно изложены в ЕР-А0473008, где также подробно описаны 25 примеров получения желаемых конечных продуктов с очень хорошими выходами (90% или более) В связи с этим следует отметить, что способ может быть промышленно внедрен, только если выходы достаточно высоки (около 90%) и конечный продукт легко очищается а-замещенные а-аминокислоты и их реакци онно-способные производные для использования в качестве исходных веществ упоминаются в ЕРА-0473008 в общих фразах, а единственной конкретно упомянутой аминокислотой является лишь метиловый эфир D-фенилглицина Заявители провели многочисленные тщательные экспериментальные исследования, следуя методике, описанной в примерах, данных в ЕР-А0473008 Однако, полученные результаты оказались полностью обескураживающими В этом отношении, было подтверждено, что, если в реакционной среде молярное отношение упомянутых аминокислот составляет менее чем 4 моля на моль используемой 6аминопенициллановой или 7аминоцефалоспорановой кислоты, выход желаемого конечного продукта оказывается очень низким (менее чем приблизительно 60%), и, по существу, является промышленно неприемлемым Хорошие, промышленно приемлемые выходы получены, только если количество метилового эфира D-фенилглицина в реакции находится в отношении от 4 до 6 молей на моль используемой 6-аминопенициллановой или 7аминоцефалоспорановой кислоты Однако, в этом случае имеет место не только неприемлемое повышение стоимости (цена метилового эфира D-фенил-глицина очень высока), но, кроме того, образование побочных продуктов, которые трудло или невозможно удалить из желаемых конечных продуктов реакции - пенициллинов или цефалоспоринов Были предприняты попытки использования различных эфиров D-фенилглицина или эфиров различных аминокислот Однако, все эти попытки оказались безуспешными Столь же отрицательные результаты были получены при использовании различных реакционно-способных производных аминокислот В заявке на патент Германии DOS 2214444 сообщается о ферментативном синтезе цефалоспоринов (в частности, цефа-лексина) путем взаимодействия 7-ADCA (7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты) с амидом фенилглицина в присутствии фермента пенициллинацилазы Полученные выходы очень низки В PCT/DK91/00188 (W092/01061) и PCT/DK92/00388 (W093/12250) сообщается о способах получения [3-лактамовых антибиотиков путем ферментативного ацилирования, в соответствии с которыми амид формулы (III) (ні) взаимодействует с 6аминопенициллановой или 7-аминоцефалоспорановой кислотой в присутствии иммобилизованного фермента пенициллин-ацилазы Эти методы могут быть внедрены Обнаружено, однако, что заметное количество амида (III) гидролизуется самим ферментом, увеличивая, таким образом, количество примесей в желательных конечных продуктах Небольшое количество конечного продукта также гидролизуется тем же ферментом Еще при первоначальном применении пенициллин-ацилазы (Е G 3 5 1 11) стало известно, что этот фермент ингибируется в присутствии фенилуксусной кислоты, фенокси-уксусной кислоты и/или других ингибиторов, в присутствии которых фермент утрачивает активность, и катализ имеет тенденцию к прекращению Это является проблемой при ацилировании р-лактамовых циклов, которые могут содержать следы фенилуксусной кислоты, феноксиуксусной кислоты или других ингибиторов Вплотную встала проблема поиска ферментов,для которых не проявляется этот тип ингибирования (см D D Y Ryu et al , Biotechnology and Bioengineenng 1985, vol XXVII, pages 953-960, A M Blmkowsky et al , Enzyme Microbial Technology 1993, vol 15, pages 965-973) Были отобраны ферменты (часто именуемые как ампициллинацилаза или амидаза, цефалоспорин-ацилаза или амидаза, цефалексин-синтезирующий фермент и т п ), имеющие происхождение из различных микробиологических источ-нико'в (виды Acetobacter, виды Xantomonas) Однако, ни один из этих ферментов не имеется в продаже, они также не производятся в больших масштабах, как было бы необходимо для промышленного применения Таким образом, этот подход оказывается непригодным из-за того факта, что требуются значительные инвестиции в исследования с целью завершения разработки конкретного катализатора для синтеза р-лактамовых антибиотиков 44709 лоспоринов формул (I) и (II) соответственно, определяемых как и ранее, в котором 6аминопенициллановая или 7аминоцефалоспорановая кислота формулы (IV) или (V) Другой метод преодоления ингибирования фермента состоит в том,чтобы удалить названные ингибиторы до оказания ими воздействия на ферментативное ацилирование, например, путем экстракции органическим растворителем, как описано в PCT/DK91/00188 Основным недостатком этого метода является именно использование органических растворителей Так как ферментативное ацилирование р-лактамовых ядер вводится именно для того, чтобы обойтись без указанных растворителей и, следовательно, добиться, чтобы процессы были экологически безопасными, то из этого следует, что такой подход все еще не дает удовлетворительных результатов При проведении конкретных исследований реакций, катализируемых пенициллин-ацилазой, заявители неожиданно открыли, что указанного ингибирования можно избежать и, слндовательно, провести синтез р-лактамовых антибиотиков в присутствии даже больших количеств вышеупомянутых ингибиторов В некоторых случаях оказывается даже возможным использовать ингибирование фермента в полезном для синтеза отношении, как описано ниже, путем введения определенного количества ингибитора, который изначально отсутствует или присутствует лишь в малых количествах Следовательно, настоящее изобретение относится к усовершенствованному ферментативному процессу получения пенициллинов и цефа (IV) в которых X и Ri имеют значения, определенные выше, взаимодействуют при температуре между -5°С и +35°С, в присутствии фермента пенициллин-ацилазы в свободной или иммобилизованной форме, с амидом формулы (III) (Ill) в которой R имеют значения, определенные выше, R2 и R3 являются каждый независимо атомом водорода или линейной либо разветвленной С-і-Сз алкильной группой, или с его солями, в молярном отношении от 1 до 6 моль указанного амида (III) на моль кислоты (IV) или (V), заключающимся втом, что в реакционную смесь добавляют ингибитор фермента формулы сн (VI) R4 является линейной либо разветвленной С1-С5 алкильной группой, замещенным или незамещенным ароматическим кольцом, галогеном или протоном, Y может отсутствовать или, в случае присутствия, обозначать О, S, СЬЬ, фенил или галоген, RS является карбоксильной группой, линейным либо разветвленным С1-С4 эфиром или CONH2 группой, R6 представляет Н, ОН, ОСНО или СНз, при этом ингибитор присутствует в молярной концентрации от 0,0001 до 0,5 В частности, указанный ингибитор (VI) присутствует в молярной концентрации от 0,0005 до 0,2 и выбирается из числа фенилуксусной кислоты, феноксиуксусной кислоты и миндальной кислоты, и (линейных или разветвленных) С1-С5 амидов и эфиров этих кислот Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим пенициллины или цефалоспорины, полученные описанным в настоящем изобретении способом, и фармацевтически приемлемые разбавители или носители Фармацевтические составы, содержащие пенициллины или цефалоспорины, обычно готовятся стандартными методами и вводятся в организм в подходящих фармацевтических формах Что касается формул (I) и (II), R может быть, например, фенильной группой, циклогексадиенильной группой или циклогексенильной группой, 44709 8 затора в настоящем способе является пеницилнезамещенной или замещенной гидро-ксилом, лин-амидогидролаза, классифицируемая как галогеном, алкилом, алкоксигруппой, карбоксиЕ С 3 5 1 11 (известная также как пенициллинлом, нитро-или -аминогруппой ацилаза, пенициллин-гидролаза,ампициллинRi может быть атомом водорода, атомом гаацилаза и т д ) полученная из любых микробиолологена, метиль-ной группой или метиленовой гических источников и, в частности, из штаммов группой, связанной с органической группой, в осоXantomonas, Pseudomonas, Arthrobacter, Kluyvera, бенности с алкоксигруппой или алкоксикарбоAcetobacter, Eschenchia, Bacillus или Acromonas нильной группой или 5- или 6-членной гетероцикФерменты, полученные из естественных или ислической группой, содержащей от 1 до 4 кусственных штаммов Eschenchia col і особенно гетероатомов из числа О, S и N, присоединенной к предпочтительны Некоторые из них имеются в метиленовой группе атомом О, S или N и необязапродаже в больших количествах и в иммобилизотельно замещенной одной или более группами из ванной форме числа следующих гидро-ксил, галоген, алкил, алкокси, карбонил, карбокси, циано, амино и т п Фермент может быть использован в свободной форме (те растворимой) или может быть Использованные здесь термины алкил и алиммобилизован на твердой матрице Из числа кокси относятся к группам, включающим от 1 до 6 последних особенно предпочтительны подложки, атомов углерода, и предпочтительно, от 1 до 4 специально предназначенные для иммобилизации атомов углерода биомолекул, такие как синтетические эпоксидные а-аминокислоты, имеющие амиды формулы или азлактоновые смолы (III), включают, например, D-фен ил глицин, D-napaгидроксифенилглицин и О-1,4-циклогексадиен-1Примері ил-глицин Синтез цефалексина путем ферментативного ацилирования 7-ADCA О(-)фенилглицинамидом Подходящими солями амидов являются соли неорганических кислот, таких как соляная, плави9г (42ммоль) 7ковая, бромистоводородная, серная или азотная аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты и кислота, или органических кислот, таких как уксус15,7г (ЮОммоль) О(-)фенилглицинамида раствоная, муравьиная или малеиновая кислота ряли в воде (конечный объем 300мл) Раствор охлаждали до приблизительно 4°С и доводили рН Из соединений формул (IV) и (V) особый интедо 6,8, затем перемещали в охлаждаемый реакрес представляют следующие кислоты бтор, связанный с регулирующей системой (далее аминопенициллановая кислота (6-АРА), 7называемой здесь рН-стат), поддерживающий рН аминодезацетоксицефалоспорановая кислота (7постоянным путем автоматического добавления 4 ADCA), 7-амино-цефалоспорановая кислота, 7н серной кислоты амино-3-хлорцефало-спорановая кислота, 7амино-3-метоксицефалоспорановая кислота, 75400IU фермента пенициллинамино-фенацетилдезацетоксицефалоспорановая амидогидролазы в иммобилизованной форме (на кислота, 7-аминофеноксиазлактоновой или эпоксидной смоле) добавляли к вышеуказанному раствору, поддерживая постоянацетилдезацетоксицефалоспорановая кислота, 7ные значения 4°С и рН 6,8 амино-3-хлор-карбацефем, пенициллин G и пенициллин V Спустя приблизительно 75 минут фермент Пенициллин G или V и 7выделяли из раствора путем фильтрации К расаминофенацетилдезацетоксицефало-спорановая твору добавляли около 4 г р-нафтола, растворенкислота обычно используются как сырье для поного в разбавленном растворе каустической соды лучения 6-АРА и 7-ADCA соответственно, которые (едкого натра) Было выделено 16,6г продукта в далее используются для получения ампицилливиде на,амоксициллина, цефалексина и цефадрокомплекса цефалексин/р-нафтол с молярным ксила Вплоть до настоящего времени было необвыходом 74% от исходного цикла Из комплекса с ходимо удалять сренилуксусную или феноксиукр-нафтолом был затем получен (согласно известсусную кислоту из этих промежуточных соединеным методикам) высококачественный моногидрат ний (6-АРА и 7-ADPA), для того чтобы иметь цефалексина возможность использовать их в реакциях ферменПример2 Синтез цефалексина в присутстативного ацилирования.как описано в твии фенилуксусной кислоты PCT/DK91/00188 Возможность синтезировать эти 17г (0,077моль) загрязненной 7соединения в присутствии ингибиторов обозначааминодезацетокси-цефалоспорановой кислоты, ет, что синтез может успешно протекать без необсодержащей в качестве примеси 1,18% фенилукходимости очистки промежуточных продуктов, что сусной кислоты и 1,63% 7приводит к большой экономичности способа и аминофенацетилдезацетокси-цефа-лоспорановой возможности избежать использования органичекислоты,и 42,68г (0,28моль) D(ских растворителей )фенилглицинамида растворяли в воде до конечного объема 600мл Ингибитор фермента может либо присутствовать в реакционной смеси в начале синтеза, либо Устанавливали рН-стат на рН 7,6, а термостат добавляться в любой момент во время протекана 2°С, использовали 7560IU иммобилизованного ния реакции Указанный ингибитор может быть фермента и затем проводили реакцию как описатакже добавлен в конце ферментативной реакно в Примереї Реакцию прерывали через 5 часов ции, чтобы облегчить выделение продукта и по30 минут и отфильтровывали пенициллинследующую обработку в целом ацилазу Продукт осаждали 6г р-нафтола, получая молярный выход 87,5% Затем получали моногидФерментом, используемым в качестве катали 44709 10 рат цефалексина как описано в Примере 1 цефаклор/ІІ-нафтол, как это описано в Примерах 1-3 в отношении цефалексина ПримерЗ Синтез цефалексина из 7Молярный выход 7-амино-Заминофенацетилдезацетоксицефало-спорановой хлорцефалоспорановой кислоты составил 70% кислоты и О(-)фенилглицинамида Моногидрат цефаклора был получен разложением комплекса цефаклор/&-нафтол (согласно извест16г (0,048моль) 7ным методам) аминофенацетилдезацетокси-цефало-спорановой кислоты растворяли в воде, добавляя достаточПример5 ное [количество] разбавленного NaOH, чтобы досФерментативное ацилирование 6тичь рН 8,0, после чего раствор нагревали до 28°С аминопенициллановой кислоты в присутствии ини разбавляли водой до конечного объема 320мл, а гибиторов затем перемещали в подходящий реактор, свя6-аминопенициллановую кислоту (обозначаезанный с рН-статом и погруженный в баню с регумую здесь далее как 6-АРА) получали из пенициллируемой температурой лина G ферментативным гидролизом, используя известные методы, и выделяли из водного расОколо 14000IU фермента пенициллинтвора путем осаждения кислотами Полученный ацилазы в иммобилизованной форме добавляли к таким образом продукт содержит примеси 20,8г этому раствору (раствор А), поддерживая при влажной загрязненной 6-АРА с содержанием осэтом постоянный рН 6,8 (путем добавления 2 н новного вещества 80% (0,077 бмоль) растворяли в NaOH) и постоянную температуру воде и смешивали с О(-)фенил-глицинамидом как Водный раствор О(-)фенилглицинамида при описано в Примере2, с получением раствора, соконцентрации около 180г/л (раствор В) готовили держащего около 0,7г/л фенилуксусной кислоты отдельно Добавляли 6670 единиц пенициллин-ацилазы и После приблизительно двух часов протекания проводили реакцию как описано в Примере2 Стереакции к раствору А добавляли около 190мл распень конверсии 6-АРА составила 82,4% твора В, корректируя при необходимости рН и температуру Значение рН поддерживали постоПримерб янным путем добавления 4 н серной кислоты Гидролитическое ингибирование (пенициллин Семь часов спустя фермент удаляли фильтС)-ацилазы в процессе синтеза цефалексина в рования под вакуумом Цефалексин выделяли из присутствии фенилуксусной кислоты полученного раствора путем 13г (60,7ммоль) 7осаждения комплекса цефалексин/р-нафтол в аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7количестве, соответствующем молярному выходу ADCA), 46,5г (230,84ммоль) гидрохлорида мети80,8% Моногидрат цефалексина достаточного лового эфира О(-)фенилглицина и 140мг для продажи качества выделяли из комплекса (1,03ммоль) фенилуксусной кислоты растворяли в цефалекс и н/li-нафтол согласно известным метоводе до конечного объема 1000мл дикам Ацилирование проводили при помощи 17,5г (3000IU) (пенициллин С)-ацилазы, в условиях наПример4 чального рН 7,25 и температуры 3°С Через приИспользование ингибиторов в ферментаблизительно 3 часа 93% 7-ADCA превратилось в тивном ацилировании 7-амино-Зце-фалексин хлорцефалоспорановой кислоты Реакцию проводили как в Примереї, однако При степени конверсии 7-ADCA в цефалексин использовали 9,85г (0,04 моль) 7-амино-З93% молярное отношение произведенного синтехлорцефалоспорановой кислоты По окончании тического цефалексина к образованному гидролиреакции добавляли 1,5г фенилуксусной кислоты, тически D-фенилглицину составило 2,15 в сравнерастворенной в разбавленном NaOH, после чего нии с отношением 1,44, полученным без осаждали комплекс ингибитора ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90