Спосіб отримання речовини для лікування захворювань підшлункової залози

Винахiд стосується галузi бiологiї та медицини та може бути використаним в бiотехнологiї добування бiологiчно активних речовин (БАР) високої активностi для лiкування захворювань пiдшлункової залози. Iснуючi на сьогоднiшнiй день препарати не спроможнi проявляти регенераторний ефект у вiдношеннi тканин пiдшлункової залози. Вiдомо, що полiпептиднi речовини мають бiорегуляторнi функцiї, наприклад фактори росту, вони не видоспецифiчнi та мають низьку алергогеннiсть. Найбiльш близьким є спосiб отримання бiологiчно активної речовини (БАР), що володiє регенераторною та модулюючою дiєю, а саме тiмалiну, що включає зневоднення подрiбненого до розмiрiв 2х2х2 мм тимусу, попередньо очищенного вiд жиру, судин i т.iн., в ацетонi у спiввiдношеннi 1:8 при 4 оС на протязi 12 годин, сушiння одержаного матерiалу, його екстракцiю 3% розчином оцтової кислоти (рН 3–4,5) в присутностi 0,1% хлориду цинку при 4оС на протязi 3 годин, фiльтрування реакцiйної сумiшi, осадження iз фiльтрату ацетоном, взятому у спiввiдношеннi 1:10 при 4оС на протязi 12 годин, обробку отриманого осаду сумiшшю ацетона з ефiром, сушку та лiофiлiзацiю препарату. Однак даний препарат не володiє органоспецифiчнiстю при лiкуваннi патологiй конкретних органiв, а саме захворювань пiдшлункової залози, а лише корегує неспецифiчнi порушення в системах iмунітету, гемостазу та неспецифiчної резистентностi органiзму. В основу винаходу поставлено задачу одержання препарату, що володiє регенераторною дiєю на тканини пiдшлункової залози, викликаючи пролiферацiю клiтин островкiв. Поставлена задача вирiшується в способi одержання БАР для лiкування захворювань пiдшлункової залози тим, що включає обезводнення подрiбненого тканевого матерiалу в органiчному розчиннику, кислотну екстракцiю в присутностi 0,1% розчину хлоридiв цинку та магнiю, фiльтрацiю реакцiйної сумiшi, осадження iз фiльтрату органiчним розчинником, обробку одержаного осаду ефiром з наступним розчиненням його в дистильованiй водi та лiофiлiзацiю одержаного препарату, в котрiм згiдно винаходу в якостi тканевого матерiалу використовують свинячу пiдшлункову залозу, зневоднений гомогенат сушать, в якостi кислоти для екстракцiї використовують 0,5% розчин трихлороцтової кислоти, обробку фiльтрату проводять ацетоном, взятим в спiввiдношеннi 1:10, а осадження ведуть сумiшшю ацетона з ефiром у спiввiдношеннi 1:10. Спосiб здiйснюється таким чином. Свинячу пiдшлункову залозу подрiбнюють до розмiрiв 2х2х2 мм, пiсля цього заливають одержану масу холодним (+4oC) ацетоном (особливо чистим) у спiввiдношеннi 1:8. Пiсля 48 годин витримки при +4oC ацетон зливають, масу що залишилась висушують. Пiсля цього її змiшують у спiввiдношеннi 1:10 з 0,5% розчином трихлороцтової кислоти (з 0,1% хлоридом цинку та 0,1% хлоридом магнiя) та на протязi 72 годин постiйно перемiшують при +4oC. Рiдку частину сумiшi пiсля фiльтрацiї через полотно та фiльтри (0,2 мм) змiшують з ацетоном у спiввiдношеннi 1:10, витримують 36–48 годин при +4oC. Дисперсну частину вiдмивають ацетоном та ефiром у спiввiдношеннi 1:10 та висушують. Одержану речовину розчиняють в дистильованiй водi (рН 4,5) у спiввiдношеннi 1:10 та лiофiлiзують. Проведено хроматографiю одержаної речовини з використанням колонок 280 мм, заповнених сорбентом "Силасорб С–18". Елюент: 1,8 мл Н2О + 3 мл CH3CN + 0,05 M NH4CH3COOH. Детекцiя проводилась при довжинi хвилi 210 нм. Хроматограма речовини показана на фiг. 1. Питома вага фракцiї I – 10,91%, фракцiї II – 89,09%. Час утримання фракцiї I – 3 хв., фракцiї II – 10,75 хв. Таким чином препарат являє собою комплекс двох пептидiв. Вивчено дiю отриманої бiологiчно активної речовини. Експеримент був проведений на 40 щурах лiнiї Wistar обох статей, середньої маси 200 г. Експериментальнi тварини були подiленi на чотори групи: I група (10 щурiв) – контрольна II група (10 щурiв) – тваринам кожен день на протязi 14 дiб внутрім'язово вводили отриману речовину на фiзiологiчному розчинi (0,5 мл) у дозi 0,1 мг сухої речовини на щура, пiсля чого тварин забивали. III група (10 щурiв) – тваринам виконували резекцiю 1/2 пiдшлункової залози. Тварин забивали через 14 дiб. IV група (10 щурiв) – тваринам виконували резекцію 1/2 підшлункової залози та на протязі 14 дiб кожен день вводили внутрішньомязово отриману речовину на фізіологічному розчині (0,5 мл) у дозі 0,1 мг сухої речовини на щура. Забивали тварин через 14 діб. Нi в однiй групi летальностi не було. Для об'єктивного контролю дiї отриманої бiологiчно активної речовини у всiх тварин брали пiдшлунковi залози для гiстологiчного дослiдження, а також кров для визначення вмiсту глюкози (таблиця). Як видно з таблицi, середнiй вмiст глюкози кровi щурiв контрольної групи був 5,58 ммоль/л (100%); у щурiв, яким вводили одержану речовину (група II) вмiст глюкози кровi був 5,06 ммоль/л (90,68% вiд контрольної групи); в групi оперованих тварин (III група), яким не вводили одержану речовину, вмiст глюкози кровi був 7,72 ммоль/л (138,35% вiд контрольної групи); у тварин, яким виконали резекцiю пiдшлункової залози i вводили одержану речовину (IV група ) вмiст глюкози кровi становив 5,53 ммоль/л (99,1% вiд контрольної групи). Таким чином можна стверджувати, що отримана речовина має цукрознижуючi властивостi при введенi її iнтактним тваринам (друга група), та нормалiзує вмiст глюкози в кровi при недостатнiй кiлькостi вироблення iнсулiну пiсля резекцiї частини пiдшлункової залози в експериментi. При вивченнi гiстологiчних препаратiв першої групи тварин (контрольна) спостерiгаються островки Лангерганса звичайних розмiрiв та залозистi клiтини (фiг. 2). В другiй групi тварин, яким вводили отриману речовину на протязi 14 дiб звертає на себе увагу помiрно виражена гiпертрофiя залозистих клiтин та гiпертрофiя островкiв Лангерганса за рахунок гiперплазiї клiтин (фiг. 3). В третiй групi тварин, яким виконана резекцiя 1/2 пiдшлункової залози, знайдено звичайну компенсаторну гiпертрофiю залозистих клiтин та клiтинну гiперплазiю островкового апарату (фiг. 4). В четвертiй групi тварин, яким виконано резекцiю 1/2 пiдшлункової залози та вводили отриману речовину на протязi 14 дiб звертає на себе увагу гiпертрофiя залозистих клiтин та рiзко виражена клiтинна гiперплазiя тканини острiвкiв Лангерганса з їх фрагментацiєю (фiг. 5, 6). Таким чином можна стверджувати, що одержана бiологiчно активна речовина має регенераторний вплив на залозисту тканину пiдшлункової залози та виражений вплив на тканину острiвкiв Лангерганса, що виражається у цукрознижуючому ефектi. Вмiст глюкози кровi у тварин чотирьох групп (по методу Хагедорна-Йенсена; ммоль/л) № п/п тварини I група II група III група IV група 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 В середньому 5,56 5,78 5,24 5,81 5,35 5,48 5,92 5,28 5,74 5,63 5,58 100% 4,76 4,99 5,13 4,53 5,63 5,05 4,89 5,93 4,78 4,92 5,06 90,68% 6,93 7,16 7,38 6,95 8,14 7,59 8,24 9,13 7,19 8,53 7,72 138,35% 5,76 5,21 5,88 5,19 5,16 6,13 4,83 5,99 6,18 5,05 5,53 99,1% Фіг. 1 Фіг 2. Підшлункова залоза щура I групи. 1. Острівок Лангерганса 2. Звичайна залозиста тканина Фарбування – гематоксилин-еозин, збільшення – 80х Фіг 3. Підшлункова залоза щура II групи. 1. Острівок Лангерганса 2. Залозисті клітини Фарбування – гематоксилин-еозин, збільшення – 80х Фіг 4. Підшлункова залоза щура III групи. 1. Острівок Лангерганса 2. Залозисті клітини Фарбування – гематоксилин-еозин, збільшення – 80х Фіг 5. Підшлункова залоза щура IV групи. 1. Острівок Лангерганса 2. Залозисті клітини Фарбування – гематоксилин-еозин, збільшення – 80х Фіг 6. Підшлункова залоза щура IV групи. 1. Острівок Лангерганса 2. Залозисті клітини Фарбування – гематоксилин-еозин, збільшення – 80х Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03