Спосіб одержання засобу з протизапальною, мембраностабілізуючою та антимікробною активністю

Спосіб одержання засобу з протизапальною, мембраностабілізуючою та антимікробною дією, що включає екстракцію кори дуба гарячою водою з подальшим очищенням та концентруванням одержаного екстракту, який відрізняється тим, що екстракцію кори дуба, подрібненої до розміру часток 1,0мм, здійснюють у вакуумнофільтраційному екстракторі при температурі води 85-95°С до одержання 5-6 об'ємів екстракту на одиницю маси сировини. (19) (21) u201002924 (22) 15.03.2010 (24) 11.10.2010 (46) 11.10.2010, Бюл.№ 19, 2010 р. (72) ЯРНИХ ТЕТЯНА ГРИГОРІВНА, ХОХЛЕНКОВА НАТАЛЯ ВІКТОРІВНА, БУРЯК МАРИНА ВАЛЕРІЇВНА, ЯКОВЛЕВА ЛАРИСА ВАСИЛІВНА, ТКАЧОВА ОКСАНА ВІТАЛІЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ 3 Відомий також спосіб одержання засобу, що має антимікробні, імуномоделюючі, виразкозагоювальні та антикоагулятивні властивості [3], згідно з яким кору дуба екстрагують дистильованою водою у масовому співвідношенні 1:12-15 при 70-80°С трикратно, при цьому першу екстракцію проводять протягом 120хв., а наступні протягом 60 хв., об'єднанні витяги се парирують, упарюють до 1/3 попереднього об'єму, знов сепарують і сушать шляхом розпилення. При здійсненні зазначеного способу кору дуба подрібнюють до розміру часток 10мм. У описанні технологічного процесу, як одного з прикладів реалізації відомого способу, зазначено, що у реакторі до початку роботи створюється тиск 0,07МПа (0,7кгс/см) за допомогою інертного газу (азоту), після чого завантажують воду, а потім сировину. Екстракцію здійснюють при перемішуванні протягом фіксованого часу. Після завантаження процесу витяг за допомогою тиску інертного газу перетискують крізь фільтрувальний матеріал несправжнього дна екстрактора до збірника. Цільовий продукт, одержаний за відомим способом сухий екстракт з зазначеними вище фармакологічними властивостями. До недоліків відомого способу можна віднести фіксований, досить тривалий час екстракції, проблематичність вичерпного вилучення комплексу біологічно активних речовин (БАР) з сировини внаслідок її подрібнення до досить великих часток, необхідність використання азоту для проведення процесу, додаткове здійснення перемішування у процесі екстрагування та подвійну сепарацію одержаного екстракту, що призводить до зростання економічних витрат на здійснення способу. Завдання корисної моделі полягає у створенні нового способу одержання густого екстракту кори дуба, який завдяки використанню вакуумно фільтраційної екстракції при заданих параметрах способу забезпечує виснаження сировини мінімальною кількістю екстрагента і одержання висококонцентрованого густого екстракту з протизапальною, мембраностабілізуючою та антимікробною дією, придатного до безпосереднього використання або при створенні лікарських засобів у різних лікарських формах. Поставлене завдання вирішується таким чином, що у способі одержання засобу з протизапальною, мембраностабілізуючою та антимікробною дією, що включає екстракцію подрібненої кори дуба гарячою водою з подальшим очищенням та концентруванням одержаного екстракту, винаходом передбачено, що екстракцію кори дуба, подрібненої до розміру часток 1,0мм, здійснюють за допомогою вакуумно фільтраційної екстракції при температурі води 85-95°С до одержання 5-6 об'ємів витягу на одиницю маси сировини, а одержаний витяг фільтрують та упарюють до залишкової вологості не більше 25%. Параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом. Одним з вирішальних факторів у підвищенні виходу діючих речовин та інтенсифікації процесу екстракції є подрібнення рослинного матеріалу. Основна мета подрібнення - максимальне руйнування клітинних структур з метою збільшення поверхні контакту екстрагенту з сировиною. Подріб 53420 4 нення кори дуба до розмірів часток 1,0мм обумовлює розчинення і фронтальний змив БАР з високо розвинутої поверхні подрібненого рослинного матеріалу. Така ступінь подрібнення сировини досягається вальцюванням. Використання вакууму забезпечує максимальне вилучення БАР з сировини і одержання висококонцентрованих витягів, дозволяє різко скоротити час екстракції, що не лише економічно вигідно, а й попереджає небажані процеси взаємодії груп екстрагованих речовин та хімічні перетворення (окислення, гідроліз тощо) окремих речовин, які виникають при тривалому екстрагуванні. Вибір в якості екстрагента води 85-95°С забезпечує ефективне вилучення у відповідності з заявленим способом з кори дуба комплексу БЛР переважно з протизапальними, мембраностабілізуючими та антимікробними властивостями. Експериментальним шляхом було визначено, що 5-6-кратний по відношенню до маси повітряно сухої сировини об'єм одержаного за заявленим способом витягу містить понад 90% від загального вмісту екстрактивних речовин у корі дуба. Одержання більшого об'єму витягу не призводить до суттєвого зростання цього показника і є економічно недоцільним. Час проведення екстракції на відміну від прототипу не є фіксованою величиною. Він змінюється у залежності від маси та товщини шару сировини у екстракторі і варіює від декількох хвилин до декількох годин. Окремі параметри заявленого способу відомі і застосовуються у фармацевтичному виробництві, проте заявлена сукупність ознак способу переробки саме кори дуба є новою, невідомою з джерел інформації та такою, що забезпечує одержання кінцевого продукту з зазначеним спектром фармакологічної активності. Заявлений спосіб здійснюється наступним чином. Подрібнену до розміру часток 1,0мм кору дуба завантажують у вакуумно фільтраційний екстрактор з несправжнім дном, додають воду при 8595°С у кількості необхідній для одержання 5-6 об'ємів витягу на одиницю маси сировини. Витяг отримують за допомогою вакууму. Відфільтрований через несправжнє дно під впливом вакууму витяг додатково фільтрують та упарюють на вакуум-випарному апараті до залишкової вологості не більше 25%. Одержують продукт у формі густого екстракту коричневого кольору з характерним запахом, придатний до тривалого зберігання. Корисна модель ілюструється прикладами. Приклад 1. 205,0г кори дуба подрібнили методом вальцювання на валковій дробарці марки ВП-320-160-160 та просіяли крізь сито з розміром отворів (1,0±0,03) мм. Втрата сировини після стадій подрібнення і просіювання склала 5,0г. Вміст екстрактивних речовин у сировині становив 15,85%. 200,0г подрібненої сировини помістили в вакуумно фільтраційний екстрактор. Додали 1800мл води очищеної (температура 95°С) до отримання після вакуумування 6-кратного об'єму витягу по відношенню до маси сировини, тобто 1200мл. Процес тривав 5 хвилин. Після додаткової фільт 5 53420 рації 1200мл одержаного витягу помістили у вакуум-випарний апарат і згустили при температурі 65°С і залишковому тиску 70кПа/см2 до отримання густого екстракту з вологістю не більше 25%. Контроль упарювання проводили за кількістю води, що відігналася у збірнику (близько 1180мл). Отримали 20,0г густого екстракту кори дуба. Вміст дубильних речовин в отриманому екстракті склав 60% в перахунку на танін спектрофотометричним методом в УФ-області спектру. Отриманий екстракт помістили у заздалегідь підготовлений стерильний контейнер з етикеткою. Приклад 2. 100г кори дуба, подрібненої до розміру часток 1,0мм, піддали екстракції за заявленим способом за аналогією з прикладом 1. Процес тривав 2 хвилини. Одержали 10,0г густого екстракту кори дуба. Приклад 3. Протизапальну активність екстракту кори дуба (ЕКД), одержаного за заявленим способом, оцінювали за ступенем його антиексудативної дії на моделі гострого карагенінового набряку стопи у білих щурів масою 180-200г. Вибір моделі обґрунтований тим, що на різних етапах розвитку ексудативного карагенінового запалення, яке є системним, беруть участь різні ендогенні флоготропні агенти: серотонін, гістамін, кініни та простагланди 6 ни [5]. Це дозволяє опосередковано визначити наявність та механізм протизапальної дії досліджуваної субстанції. Набряк викликали субплантарним уведенням 0,1мл 1% розчину карагеніну в одну із задніх кінцівок тварин дослідних та контрольної груп через 1 годину після введення водного розчину ЕКД та препарату порівняння. Досліджуваний препарат вводили внутрішньошлунково, одноразово у діапазоні доз від 25 до 250мг/кг, а препарат порівняння Вольтарен - у дозі 8,0мг/кг. Контрольна група щурів одержувала еквівалентну кількість розчинника. Про розвиток набряку судили за збільшенням об'єму стопи, який вимірювали у динаміці через 1, 2, 3, 4 і 5 годин за допомогою механічного онкометра. Протизапальну активність препаратів визначали за здатністю зменшувати набряк у дослідних тварин у порівнянні з тваринами контрольної патології. Розрахунок проводили за формулою: Vk Vд / Vk 100%, де А - протизапальна активність, %; Vд і Vk - різниця в об'ємі набряклої та здорової стопи відповідно у дослідній групі і в групі контрольної патології. Результати досліду наведено у таблиці 1. Таблиця 1 Протизапальна активність екстракту кори дуба, одержаного за заявленим способом, і препарату порівняння на моделі карагенінового набряку у щурів, (x±Sx) Препарати 1 год. 2 год. V, у. о. А, % Контроль15,00±1,6 на пато7 логія ЕКД, 8,00±1,29* 25мг/кг ЕКД, 7,60±1,39* 50мг/кг ЕКД, 6,80±1,39* 75мг/кг ЕКД, 7,20±1,59* 100мг/кг ЕКД, 8,80±1,36* 125мг/кг ЕКД, 7,80±0,97* 150мг/кг ЕКД, 10,83±1,9 200мг/кг 0 ЕКД, 250 13,50±2,5 мг/кг 3 Вольта8,00±1,81* рен, 8мг/кг V, у. о. 30,60±0,93 3 год. А, % V, у. о. 32,20±0,86 4 год. А, % 5 год. V, у. о. А,% 32,60±1,81 V, у. о. 29,60±2,04 А, % Середня активність, А,% 46,7 13,00±1,18* 57,5 20,67±2,42* 35,8 27,67±2,12 15,1 30,17±1,49** 31,6 49,3 13,60±1,96* 55,5 25,00±2,63 22,4 23,80±4,04 27,0 23,80±3,94 19,6 34,8 54,7 17,80±3,50* 41,8 18,20±3,71* 43,5 19,60±2,01 40,0 18,20±2,01 38,5 43,7 52,0 14,80±2,06* 51,6 21,60±2,52 33,0 20,00±2,76 38,7 18,40±2,68 37,8 42,6 41,3 18,80±2,35* 38,6 19,00±2,39* 41,0 19,60±3,68 40,0 18,00±1,79 39,2 40,0 48,0 15,00±2,59* 51,0 22,00±2,19_^ 31,7 17,80±1,53 45,4 16,40±1,96 44,6 44,1 27,8 23,33±2,65** 23,8 24,17±2,40** 25,0 20,33±2,32 37,6 17,33±2,33 41,5 31,2 10,0 24,83±2,85** 19,0 26,67±3,05** 17,2 23,50±2,62 28,0 20,33±2,44 31,3 21,1 9,17±1,45* 70,0 13,00±1,10* 60,0 15,17±1,99* 53,5 12,50±2,91* 57,8 57,6 46,7 Примітки: 1)* - відхилення достовірне щодо контрольної патології, р 2) ** - відхилення достовірне щодо препарату порівняння, р 0,05; 3) V, у. о. - величина набряку в умовних одиницях; 4) А, % - протизапальна активність, %; 5) n = 6. 0,05; 7 53420 Аналіз даних таблиці 1 свідчить, що ЕКД, одержаний за заявленим способом, виявив протизапальну активність у всіх досліджених дозах. Починаючи з дози 25мг/кг і до дози 150мг/кг середня активність ЕКД поступово зростала (31-6%-44,1%). Подальше збільшення дози ЕКД до 200-250мг/кг призводить до зменшення антиексудативної активності (21,1%-31,2%). Порівняно з активністю вольтарена, активність ЕКД не поступається активності препарату порівняння на 1-й годині дослідження в інтервалі доз 25-150мг/кг. Враховуючи той факт, що вольтарен має негативну побічну дію, а досліджений ЕКД довели його нетоксичність, ЕКД має певні переваги, особливо при тривалому застосуванні. Приклад 4. Дослідження мембраностабілізуючої активності ЕКД, одержаного за заявленим способом, проведено на моделі спонтанного гемолізу еритроцитів за методом F.C. Jager [6]. Експеримент базується на спектрофотометричному визначенні при довжині хвилі 540 нм екстинкції позаеритроцитарного гемоглобіну, що надходить у кров внаслідок гемолізу еритроцитів, викликаного пероксидним окисненням ліпідів киснем повітря. Протягом 3-х днів дослідна група щурів отримувала per os водний розчин ЕКД в умовно 8 ефективній дозі 75мг/кг. Тварини другої дослідної групи отримували per os масляний розчин препарату порівняння вітаміну Е -класичного антиоксиданту в дозі 6мг/кг. Тварини інтактної групи, які слугували контролем, отримували внутрішньошлунково протягом 3-х днів питну воду. На 4-й день експерименту у щурів з хвостової вени брали кров і визначали ступінь гемолізу еритроцитів у дослідних і контрольній групах за формулою: 1 2 2 100% , де X - ступінь гемолізу, % Е1, Е2 - екстинкції першої і другої проб з робочим розчином; Е3 - екстинкція проби з дистильованою водою. Мембраностабілізувальну активність Ам розраховували за формулою: Ам =100 - Хдосл/Хконтр х 100, де Ам - мембраностабілізуюча активність,%; Хдосл - ступінь гемолізу у тварин дослідних груп; Хконтр - ступінь гемолізу у тварин контрольної групи. Результати досліду наведені у таблиці 2. 3 Таблиця 2 Мембраностабілізуюча активність ЕКД на моделі спонтанного гемолізу еритроцитів у щурів (x±Sx) Дослідні групи Контрольна група Екстракт кори дуба, 75мг/кг Вітамін Е, 6 мг/кг Ступінь гемолізу, ум. од. 17,09±1,51 11,37±1,49* 10,84±0,80* Мембраностабілізуюча активність, % 33,5 % 36,6 % Примітки: 1) * - відхилення достовірне щодо контролю, р2000мг/кг). При дослідженні специфічної токсичності встановлено, що ЕКД, одержаний за заявленим способом, не проявив кумулятивних властивостей, алергізуючої та імунотоксичної дії. При тривалому застосуванні протягом одного та трьох місяців ЕКД не чинив шкідливої дії на внутрішні органи та системи лабораторних тварин, що підтверджено біохімічними та гістологічними дослідженнями. Таким чином, заявлено новий спосіб одержання з кори дуба засобу з протизапальною, мембраностабілізуючою та антимікробною активністю, практично нетоксичного, придатного до тривалого застосування без негативної побічної дії, перспективного для одержання лікарських засобів аналогічної дії у різних лікарських формах. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Заявлений спосіб дозволяє мінімізувати час екстракції, суттєво підвищити вихід діючих речовин і одержати висококонцентрований екстракт з кори дуба з широким спектром фармакологічної активності. Джерела інформації 1. Лікарські рослини. Енциклопедичний довідник. За ред.. A.M. Гродзінського. Київ, Головна редакція Української радянської енциклопедії ім. М.П. Бажана, 1991, С. 142-143. 2. Компендиум Лекарственные препараты 2008. В двух томах. Под ред. В.Н. Коваленко, А.П. Викторова. «Морион», киев, 2008, Т. II, С. 83. 3. Патент на винахід 2092173, РФ, МПК 6 А61К35/78, заявл. 03.11.92, опубл. 10.10.97, бюл. №28. 4. Т.П. Попова, А.С. Амосов, В.И. Литвиненко, В.М. Мишев Фильтрационная экстракция и ее аппаратурное оформление / Фармаком, №2-3, 1994, С. 43-49. 5. Di Rosa M., Giround J.P., Willougby D.A. Studies on the mediators of the acute inflammatory response induced in rats in different sites by carragenen and turpentins // J.PathoL- 1971.- V. 104.- №15. - P. 29. 6. Вороніна Л.М., Десенко В.Ф., Кравченко В.М. та ін. (1996) Посібник до лабораторних і семінарських занять з біологічної хімії.- Харків.: Основа, 432с. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601