Спосіб оцінки метаболічних порушень у ротовій порожнині при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті

Спосіб оцінки глибини метаболічних порушень у ротовій порожнині при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті, що передбачає визначення вмісту у нестимульованій слині біологічно активних речовин, який відрізняється тим, що 5 мл нестимул ьованої слини вносять в мірну Винахід, який заявляється, стосується галузі медицини, а саме стоматологи, та призначений для оцінки метаболічних порушень у ротовій порожнині при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті(ХРАС) В структурі стоматологічних захворювань постійно зростає питома вага хронічних деструктивних уражень слизової оболонки порожнини роту Найбільш поширеною нозологічною формою у вказаній групі захворювань є хронічний рецидивуючий афтозний стоматит Провідним фактором, що обумовлює виникнення ХРАС, є формування комплексу глибоких метаболічних змін у порожнині рота Одним з інтегральних показників дисметаболічного стану у пацієнтів з ХРАС є порушення обміну ЛІПІДІВ Є переконливі докази, що підтверджують роль ЛІПІДІВ у функціонуванні різних мембранних систем Метаболіти ЛІПІДІВ є джерелом для цілого ряду біологічно активних речовин(простагландинів, тромбоксанів, лейкотрієнів), що беруть активну участь у регулюванні механізмів запалення Виникнення ХРАС є наслідком значних змін ЛІПІДНОГО обміну і системи перекисного окислення ЛІПІДІВ(ПОЛ) Оптимальним субстратом для ПОЛ є фосфоліпіди бюмембран, точніше ненасичені(полієнові) жирні кислоти, що входять до їх складу Від нормального вмісту полієнових жирних кислот(линолевоі, лино пробірку, ДВІЧІ здійснюють процедуру екстракції ЛІПІДІВ і їх концентрування шляхом випарювання та виконують екстракцію метильованих продуктів, після чого об'єднані гексан-ефірні екстракти концентрують до повного висихання, сухий осад розчиняють у 50 мкл гексан-ефірної суміші, вводять у випарник газового хроматографа "Цве-500" і визначають вміст окремих фракцій жирних кислот ЛІПІДІВ за методом нормування площин та при збільшенні вмісту линолевої (С-І8 2) і арахідонової жирних кислот (С204) понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО діагностують порушення метаболізму у порожнині рота ленової, арахідонової) залежить пластичність, рухомість мембран, виконання ними найважливіших функцій(диференційованоі проникності, активного транспорту ІОНІВ і метаболітів, захисту і опірності, участі в передачі збудження, здатності скорочуватись тощо) Пошкодження цих компонентів в процесі ПОЛ негативним чином відзначається на всіх функціях мембран Наслідком активізації ПОЛ є адаптивна перебудова структури ЛІПІДНОГО шару бюмембран зі зміною співвідношення фосфоліпідів у напрямку ПІДВИЩеННЯ Концентрації ДІЄНОВИХ(ЛІНОЛЄВОІ С-І8 2) І тетраєнових(арахідоновоі С204) жирних кислот Таким чином, порушення стану ЛІПІДНОГО обміну при ХРАС може розглядатись як інтегральний показник, що характеризує метаболічні зміни у порожнині рота Існуючі способи оцінки метаболічних порушень у ротовій порожнині при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті дають можливість з'ясувати ступінь активації чи пригнічення окремих факторів резистентності, але не дозволяють інтегрально оцінити стан гомеостатичних механізмів Так, відомий спосіб оцінки глибини метаболічних порушень у ротовій порожнині при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті шляхом вивчення мікробюценозу слини [1] Однак, вказаний О со го ю 54330 спосіб дозволяє оцінити лише стан колонізаційної ланки резистентності порожнини рота і, таким чином, не здатен комплексно оцінити характер метаболічних змін Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення аналогом(прототипом) є спосіб оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при ХРАС шляхом визначення вмісту секреторного імуноглобуліну А у нестимульованій слині [2, 3] Однак, вказаний спосіб дозволяє охарактеризувати лише стан гуморальної ланки місцевого імунітету і не враховує сукупний вплив гомеостатичних порушень, які спричиняють формування ХРАС Формування ХРАС є наслідком змін цілого комплексу метаболічних факторів Таким чином, вказаний спосіб не дозволяє повноцінно оцінити стан метаболічних порушень у порожнині рота при ХРАС Завдання, яке вирішується у даному винаході, полягає у створенні способу оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті шляхом визначення показників, що дають інтегральну оцінку механізмів гомеостазу Технічний результат, який досягається, полягає у можливості кількісної оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті Поставлена задача вирішується завдяки тому, що у відомому способі оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті, що передбачає визначення вмісту у нестимульованій слині біологічно активних речовин, який відрізняється тим, що 5мл нестимульованої слини вносять в мірну пробірку, ДВІЧІ здійснюють процедуру екстракції ЛІПІДІВ і їх концентрації шляхом випарювання та виконують екстракцію метильованих продуктів, після чого об'єднані гексан-ефірні екстракти концентрують до повного висихання, сухий осад розчиняють у 50мкл гексан-ефірної суміші, вводять у випарник газового хроматографа "Цве-500" і визначають вміст окремих фракцій жирних кислот ЛІПІДІВ за методом нормування площин та при збільшенні вмісту линолевоі(Сі8 т) і арахідонової жирних кислот(С20 4) понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО діагностують порушення метаболізму у порожнині рота ВІДМІННОЮ особливістю способу оцінки глибини метаболічних порушень у порожнині рота при ХРАС, що заявляється, є те, що у нестимульованій слині визначають вміст продуктів метаболізму, які відносяться до класу жирних кислот ЛІПІДІВ Для цього 5мл нестимульованої слини вносять в мірну пробірку та з отриманою рідиною ДВІЧІ ЗДІЙСНЮЮТЬ процедуру екстракції ЛІПІДІВ та їх концентрування шляхом випарювання Після цього виконують екстракцію метильованих продуктів Отримані об'єднані гексан-ефірні екстракти концентрують до повного висихання, а сухий осад розчиняють у 50мкл гексан-ефірної суміші Суміш вводять у випарник газового хроматографа "Цве-500" і визначають вміст окремих фракцій жирних кислот ЛІПІДІВ за методом нормування площин Порушення метаболізму у порожнині рота діагностують при збільшенні вмісту линолевоі(Сі8 2) і арахідонової жир них кислот(С20 4) понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО Технічний результат, який досягається, полягає у можливості кількісної оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті Поставлена задача вирішується завдяки тому, що у відомому способі оцінки метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті, що передбачає визначення вмісту у нестимульованій слині біологічно активних речовин, який відрізняється тим, що 5мл нестимульованої слини вносять в мірну пробірку, ДВІЧІ здійснюють процедуру екстракції ЛІПІДІВ і їх концентрації шляхом випарювання та виконують екстракцію метильованих продуктів, після чого об'єднані гексан-ефірні екстракти концентрують до повного висихання, сухий осад розчиняють у 50мкл гексан-ефірної суміші, вводять у випарник газового хроматографа "Цве-500" і визначають вміст окремих фракцій жирних кислот ЛІПІДІВ за методом нормування площин та при збільшенні вмісту линолевоі(Сі8 т) і арахідонової жирних кислот(С20 4) понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО діагностують порушення метаболізму у порожнині рота ВІДМІННОЮ особливістю способу оцінки глибини метаболічних порушень у порожнині рота при ХРАС, що заявляється, є те, що у нестимульованій слині визначають вміст продуктів метаболізму, які відносяться до класу жирних кислот ЛІПІДІВ Для цього 5мл нестимульованої слини вносять в мірну пробірку та з отриманою рідиною ДВІЧІ ЗДІЙСНЮЮТЬ процедуру екстракції ЛІПІДІВ та їх концентрування шляхом випарювання Після цього виконують екстракцію метильованих продуктів Отримані об'єднані гексан-ефірні екстракти концентрують до повного висихання, а сухий осад розчиняють у 50мкл гексан-ефірної суміші Суміш вводять у випарник газового хроматографа "Цве-500" і визначають вміст окремих фракцій жирних кислот ЛІПІДІВ за методом нормування площин Порушення метаболізму у порожнині рота діагностують при збільшенні вмісту линолевоі(Сі8 2) і арахідонової жирних кислот(С20 4) понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО Спосіб оцінки глибини метаболічних порушень у порожнині рота при хронічному рецидивуючому афтозному стоматиті здійснюється наступним чином Порожнину рота пацієнта ополіскують фізіологічним розчином з рН7,4 протягом п'яти хвилин і пропонують сплюнути нестимульовану слину у стерильну пробірку Відібрані 5мл слини вносять у пробірку, заливають 7мл екстрагуючої суміші хлороформ-метанолу у співвідношенні 2 1 Після цього здійснюють екстракцію ЛІПІДІВ протягом ЗОхв при температурі 4°С Нижній шар, який утворюється при ПОДІЛІ фаз, відбирають піпеткою Пастера і концентрують випарюванням до повного висихання під потоком газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані До утвореного сухого залишку ЛІПІДІВ додають Змл 1% розчину сірчаної кислоти в метанолі і утворену суміш переносять в склянку об'ємом 5мл У склянку доливають метилюючу суміш і розчин шкубують на водяній бані при температурі 85°С протягом 20хв Після завершення інкубації пробу охолоджують і ДВІЧІ ЗДІЙСНЮЮТЬ екстракцію метильованих продуктів 5мл 54330 гексан-ефірної суміші у співвідношенні 1 1 Для швидкого поділу фаз додають 1мл дистильованої води Верхній шар гексан-ефірних екстрактів, який утворився при ПОДІЛІ фаз, відбирають піпеткою Пастера і концентрують шляхом випаровування під струменем газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані Сухий осад розчиняють у 50мкл гексан-ефірної суміші і вносять у випарник газового хроматографа "Цве-500" Кількісну оцінку спектру жирних кислот ЛІПІДІВ здійснюють за методом нормування площин і визначають долі кислот у відсотках Порушення метаболізму у порожнині рота діагностують при збільшенні вмісту линолевоі(С-і8 2) і арахідоновоі(С20 4) жирних кислот понад 20,8% і 4,9% ВІДПОВІДНО Протягом 1999 - 2002 років у Стоматологічній ПОЛІКЛІНІЦІ МОЗ України при НМУ їм О О Богомольця було здійснено обстеження і лікування ЗО дітей з хронічним рецидивуючим афтозним стоматитом та обстеження 29 здорових дітей віком 5 15 років Результати визначення показників метаболізму порожнини рота представлені у таблиці 1 Таблиця 1 Показники метаболізму порожнини рота Назва показника Вміст S-lgA у нести мул ьован їй слині (г/л) Линолева ЖК (С-is і) Вміст жирних кислот у Арахідонова (С204) нестимульованій слині Загальний вміст полі ненаси(%) чених жирних кислот достовірність відмінностей з показниками здорових дітей(р < 0,05) ЖК - жирні кислоти Аналіз результатів дослідження з використанням методів статистичного аналізу свідчить, що у дітей з ХРАС виявлені значні порушення метаболізму ЛІПІДІВ у нестимульованій слині порівняно зі здоровими Вказані зміни проявляються достовірним підвищенням вмісту линолевоі(Сі8 2) і арахідоновоі(С20 4) жирних кислот до 23,8 ± 3,0% і 5,6 ± 0,7% ВІДПОВІДНО порівняно зі здоровими дітьми Описані особливості метаболізму підтверджують домінування процесів альтерації внаслідок пере Групи спостереження Пацієнти з ХРАС Здорові 0,44 ±0,01 0,91 ±0,03 23,8 ± 3,0* 17,9 ±2,4 5,6 ±0,7* 3,9 ±0,5 35,2 ± 2,9* 26,8 ±1,8 будови структури ЛІПІДНОГО шару бюмембран і є передумовою для утворення деструктивних(афтозних) елементів на слизовій оболонці порожнини рота Виявлені співвідношення жирних кислот ЛІПІДІВ у слині вказують на домінування прозапальних механізмів над протизапальними Такий характер метаболічних змін підтверджує порушення гомеостатичних механізмів у порожнині рота хворих на ХРАС Статистичний аналіз результатів дослідження дозволив визначити межі значень показників у групах пацієнтів з ХРАС і здорових дітей(таблиця 2) Таблиця 2 Максимальні і мінімальні значення показників вмісту лінолевої і арахідонової жирних кислот у порожнині рота Групи пацієнтів Хворі на ХРАС Здорові Линолева(Сі8 2) 20,8 - 27,2 15,5-20,5 Аналіз отриманих даних вказує, що здорових дітей вміст у слині линолевої і арахідонової жирних кислот не перевищує 20,5% і 4,4% ВІДПОВІДНО У пацієнтів з ХРАС мінімальний вміст вказаних жирних кислот становить 20,8% і 4,9% Таким чином, граничними мінімальними значеннями показників, що вказують на порушення метаболізму у порожнині рота при ХРАС можна вважати для линолевої жирної кислоти - 20,8%, для арахідонової жирної кислоти - 4,9% Таким чином, запропонований спосіб оцінки глибини метаболічних порушень у порожнині рота при ХРАС шляхом визначення вмісту жирних кислот у нестимульованій слині дає можливість комплексно оцінити стан гомеостатичних механізмів, що обумовлюють формування деструктивних елементів на слизовій оболонці Вміст жирних кислот (%) Арахідонова (С204) 4,9-7,3 3,4-4,4 Конкретні приклади здійснення Приклад 1 Пацієнт С , 1990 року народження був оглянутий під час планової диспансеризації Скарг на виникнення уражень слизової оболонки порожнини роту в анамнезі не виявлено Порожнина рота пацієнта була санована На підставі КЛІНІЧНОГО обстеження був встановлений діагноз "здоровий" Нестимульовану слину для дослідження відібрали під час огляду Для цього порожнину рота пацієнт попередньо ополіскував фізіологічним розчином з рН7,4 протягом п'яти хвилин і сплюнув нестимульовану слину у стерильну пробірку Відібрані 5мл слини внесли у пробірку, залили 7мл екстрагуючої суміші хлороформ-метанолу у співвідношенні 2 1 Після ЦЬОГО ЗДІЙСНИЛИ екстракцію ЛІПІДІВ протягом ЗОхв при температурі 4°С Нижній 54330 шар, який утворився при ПОДІЛІ фаз, відібрали піпеткою Пастера і концентрували випарюванням до повного висихання під потоком газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані До утвореного сухого залишку ЛІПІДІВ додали Змл 1% розчину сірчаної кислоти в метанолі і утворену суміш перенесли в склянку об'ємом 5мл До утвореної рідини долили метилюючу суміш і розчин інкубували на водяній бані при температурі 85°С протягом 20хв Після завершення інкубації пробу охолодили та ДВІЧІ здійснили екстракцію метильованих продуктів шляхом додавання 5мл гексан-ефірної суміші(у співвідношенні 1 1) Верхній шар гексанефірних екстрактів, який утворився при ПОДІЛІ фаз, відібрали піпеткою Пастера і концентрували шляхом випаровування під струменем газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані Сухий осад розчинили у 50мкл гексан-ефірної суміші і внесли у випарник газового хроматографа "Цве500" Кількісну оцінку спектру жирних кислот ЛІПІДІВ здійснювали за методом нормування площин і визначили долі кислот у відсотках Вміст ЛІНОЛЄВОІ кислоти у пробі склав 18,2%, арахідонової - 4,0% Вказані показники достовірно не відрізнялись від здорових і не перевищували межі, які вказують на порушення метаболізму порожнини рота У пробі нестимульованої слини пацієнта С паралельно визначили вміст SlgA, що склав 0,98г/л, тобто знаходився в межах показників здорових людей Таким чином, метод оцінки глибини метаболічних порушень шляхом визначення вмісту жирних кислот та рівня SlgA у змішаній слині не виявив порушення гомеостазу Приклад 2 Пацієнт М , 1991 року народження(медична картка №897), поступив на лікування 20 09 2000 року зі скаргами на появу на слизовій оболонці порожнини рота болісних виразок Тривалість захворювання складала 3 роки Рецидиви ХРАС виникали 2 - 3 рази на рік Під час об'єктивного обстеження підщелепні лімфатичні вузли збільшені, ЩІЛЬНІ, рухомі, безболісні при пальпації Червона кайма губ без видимих патологічних змін Слизова оболонка порожнини рота бліда, з відбитками зубів на щоках і бокових поверхнях язика На боковій поверхні і спинці язика спостерігаються 2 афти розмірами 0,9 х 0,8см та 0,4 х 0,5см При пальпації афти ЩІЛЬНІ, болісні На підставі оцінки даних анамнезу і КЛІНІЧНОГО обстеження був встановлений попередній діагноз "Хронічний рецидивуючий афтозний стоматит, середньотяжка форма" Нестимульовану слину для дослідження відібрали під час огляду Для цього порожнину рота пацієнт попередньо ополіскував фізіологічним розчином з рН7,4 протягом п'яти хвилин і сплюнув нестимульовану слину у стерильну пробірку Відібрані 5мл слини внесли у пробірку, залили 7мл екстрагуючої суміші хлороформ-метанолу у співвідношенні 2 1 Після ЦЬОГО ЗДІЙСНИЛИ екстракцію ЛІПІДІВ протягом ЗОхв при температурі 4°С Нижній шар, який утворився при ПОДІЛІ фаз, відібрали піпеткою Пастера і концентрували випарюванням до повного висихання під потоком газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані До утво 8 реного сухого залишку ЛІПІДІВ додали Змл 1% розчину сірчаної кислоти в метанолі і утворену суміш перенесли в склянку об'ємом 5мл До утвореної рідини долили метилюючу суміш і розчин інкубували на водяній бані при температурі 85°С протягом 20хв Після завершення інкубації пробу охолодили та ДВІЧІ здійснили екстракцію метильованих продуктів шляхом додавання 5мл гексан-ефірної суміші(у співвідношенні 1 1) Верхній шар гексанефірних екстрактів, який утворився при ПОДІЛІ фаз, відібрали піпеткою Пастера і концентрували шляхом випаровування під струменем газоподібного азоту при температурі 45°С на водяній бані Сухий осад розчинили у 50мкл гексан-ефірної суміші і внесли у випарник газового хроматографа "Цве500" Кількісну оцінку спектру жирних кислот ЛІПІДІВ здійснювали за методом нормування площин і визначили долі кислот у відсотках Вміст ЛІНОЛЄВОІ КИСЛОТИ у пробі склав 25,6%, арахідонової - 6,2% Вказані показники достовірно відрізнялись від здорових і знаходились в межах, що вказують на порушення метаболізму у порожнині рота У пробі нестимульованої слини пацієнта М паралельно визначили вміст SlgA, що склав 0,94г/л, тобто знаходився в межах показників здорових людей Таким чином, метод оцінки метаболічних порушень шляхом визначення вмісту жирних кислот у змішаній слині виявив порушення гомеостазу, в той же час як рівень SlgA був незміненим Тому запропонований метод виявив вищу чутливість і інформативність У ЗО пацієнтів з ХРАС, яких ми спостерігали протягом 1999 - 2002 років, визначали глибину метаболічних змін у порожнині рота за запропонованою методикою і методом-прототипом(дивись таблицю 1) У всіх пацієнтів з ХРАС спостерігалось порушення метаболізму жирних кислот за рахунок зростання вмісту насичених і зменшення - ненасичених фракцій В той же час у 8(26,7%) пацієнтів з цієї групи вміст SlgA достовірно не відрізнявся від показників здорових Таким чином, вміст SlgA у нестимульваній слині не дозволяє повноцінно оцінити стан метаболічних змін у всіх пацієнтів з ХРАС Крім того, зниження вмісту SlgA у слині дітей з ХРАС свідчить лише про пригнічення гуморальної ланки місцевого імунітету, що не дозволяє інтегрально КІЛЬКІСНО оцінити стан метаболічних змін, що визначають формування деструктивних змін на слизовій оболонці у порожнині рота Перевагами запропонованого способу перед прототипом є те, що він дозволяє КІЛЬКІСНО оцінити глибину патогенетично значимих метаболічних змін у порожнині рота при ХРАС, дозволяє підвищити точність оцінки за рахунок використання автоматизованих вимірів, дає можливість контролювати ефективність лікування Список літератури, яка використовувалась 1 Хазанова В В , Рабинович И М , Земская Е А Изучение микробиоциноза при хронических заболеваниях слизистой оболочки полости рта // Стоматология -1996 - №2 -С 26-28 2 Mancim С , Carbonara А О , Heremans J Т Immunocemical quantation of antigens dy single Radial Immunodiffusion // Journal of Immunology 9 54330 1965 - Vol 2 -P 235-254 3 Чернохвостова Е В Количественное определение сывороточных иммуноглобулинов в ин 10 фекционной и неинфекционной патологии //Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунобиологии -1975 - №3 -С 3-10 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24