Спосіб видалення ендотоксину з культуральної рідини штаму фази i bordetella pertussis

1. Спос об уд аления э нд отокс ина из ку льту ральной жид кос ти ш тамма фазы I B ordetella pert uss is, преду сматривающ ий отд елен ие с у пернатанта ку льту ральпой жидкос ти, фракционирование его су ль фа том аммония, растворение осадка в фос фат ном бу фере, содержащем NaCI, отделение антигенс одержащего супернатанта центрифугированием, обработку его сульфатом аммония, повторное рас творение осадка в том же бу фере, д иализ полученной смес и с последу ющим центрифугированием диализата в град и ен те п ло тн ос ти с ах ароз ы в течение 10-24 час, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что к антигенсодержащ ему супернатанту д обавляю т 0, 01-0,1 милли-экв/ мл ионов кальция о прису тс твии избытка ионов фосфора и выд ерживают при температуре 425°С в течение 0,3-4 час до образования 0,01-0,1 милли-экв/мл кальций фос фатного іеля. 2. Способ по п. 1,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качес тве ионов кальция использу ют ацетат кальция или х лорид кальция или нитрат кальция. 3. Спос об по п. 1,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что центрифугирование осущес твляют в град иенте плотнос ти сахарозы от 0 д о 30 мас/ мас .% при 60000-122000 д. Нас тоящ ее изобретение относится к (1) способу удаления эндотоксина из жидкос ти, содержащей антиинфекционпую фракцию и э нд отокс ин ш таммов фазы I B ordetella pertussis пу тем зонального центрифу гирования, причем такой с пособ характеризу ется тем, что а указанную жидкос ть ввод ят ионы кальция в прису тс твии избытка фосфатных ионоо перед зональным центрифугированием и полученный в резу льтате осадок оібрасьівают; (2) способу получения токс оид а перту зисэ, х арактеризующемуся тем, что осущ ес твляю т д етокс ификацию жидкос ти, сод ерж ащ ей антиинфекционную фракцию, полученную по указанному выш е способу, и (3) токсоиду перту зис а, содержание в котором э ндотоксина в расчете на 10 мкг протеинового азота, не превыш ает 0, 5 нг. В соответс твии с метод ом удаления эндотокс ина пертузис а, согласно нас тоящ ему изобретению, отд еление антиин фек ционной фракции от э нд отокс ина может быть осуществлено более четко и чис то, в результате чего защитную фракцию легко выделить с у лучш енным выход ом. Кроме э того. (20)96240081, 28.10. 93 (21)4355806/SU (22)20.05.88 (24)28.02.97 (31)62-126394 (32)22.05.87 (33) J Р (46)28.02. 97. Бю л. Ns l (56) 1. ЕР, № 0047802, кл. С 07 G 7/00, 1982. 2. JP, № 34-2149, кл. А 61 К 39/00, 1979. С > N3 о 12647 пос кольку зональному центри фу гированию можно под вергать большой объем ис х од н ог о м а те ри а л а, в ых од токс оид а перту зис а может быть увеличен более чем вдвое, причем э ндотокс ин мож ет быть уда- 5 лен с выс ок ой э ффек тивнос тью. В связи с этим с ледует отметить, что нас тоящее изобретение является ценным а промышленном отнош ении. Кроме э того, содержание эндотоксина в 10 токсоид е перту зпеа нас тоящего изобретения сос тавляет менее од ной дес ятой в трад иционном токс оид е, а ис пользование токс оид з пертузиса нас тоящ его изобретения позволить осуществить промыш ленное 15 производс тво вакцин, такой же имму нологичес кой мощ нос ти, что и трад иционн ые вакцины, но пониженной токс ичнос ти. Упомяну тая выш е жидкос ть, с од ержащая антиин фек циоішу ю фрак цию и э ндо- 20 токс ин ш таммов фазы I B ordoielia pert ussis может предс тавлять собой, например, верх ний слой культурного бу льона, полученного при выращ ивании ш таммов фаз ы I В.pertussis или его концентрат, причем осо- 25 бекно предпочтительным является концентра т. К у лы ипи роп аи ие ш там мов фаз ы I Bordetella pertussis может проводиться традиционным метод ом. Так например, микроорганизмы выращивают в бу льонной сред е 30 (например, в сред е Кохен-Вилира или Стойкер-Шолте) при температу ре 35-37°С D течение 5-7 д н. В ерх ний с лой полу ченного таким образом культу рного бульона собирают, например, пу тем фильтрации пли цент- 35 рифугирования. Такой верх ний с/юи може г быть непосредс твенно, или пос ле концентрирования, подвергну т с ледующей с тад ии обработки с целью уд аления э ндотокс ина. К онцентрирование д ля э той цели может 40 быть осущ ес твлено пу тем ис пользования извес тны per s e методой выс аливания. Так например, 2-5 кг су ль фата аммония д обавляю т к кажд ым 10 л верх него ку льту рного слоя Y полученный и результате осад ок со- 45 бирзюг пу тем, например, фи льтрации или центри фу гирования. Такой ос ад ок затем рас творяют в соответс твующем количес тве сис темы IMх лорис того натрия-0, 05 Ы фос фатный бу фер и полученный рас твор цент- 50 рифугируют либо обрабатывают каким-либо еще спос обом с целью отделения верх него надос-эдочнего слоя. Удаление эндотоксина согласно нас тоящему изобретению заключается о том, что в 55 жидкос ть, сод ержащую аптпинфекционну ю фракцию и энд отокс ин ш таммовфазы I Bordet ella pertussis вводят ионы кальция а прису тс твии избытка иопс і фос фата, полу ченный в резу льтате осад ок отбрас ывают и маточную жидкос ть подвергают зональному центрифугированию. Если в жидкости отсу тствуют ионы фосфата, то добавляю т фос фатный бу ферный рас твор, например, 0, 05 М фос фатный бу фер, дополненный Ш х лорис того натрия и затем вводят ионы кальция. Пос тавщиком ионов кальция могу т служить такие рас творимые соли кальция, гак ацетат кальция, хлорис тый кальций, нитрат кальция и т.п., а также такие нерас творимые соли кальция, как фос фат кальция и т.п. Ос обенно пред почтительными с оед инениями являютс я ацетат кальция it х лорис тый кальций. Отношение количес тва ионов фос фата к количес тву ионов кальция с ос тавляет 1, 25-30 эквивалентов, предпочтительно, 1, 5-7,5 эк вивалентов ионов фос фата к каждому эквиваленту ионов кальция и рекоменду етс я обеспечить такой режим, чтобы образовывалос ь 0, 01-0,1 миллнэ квивалентов/ мл, предпочтительно 0,02-0,7 миллизквиоалентов кальций фос фатного гели. Обычно используют'Следующую типовую методику. Предполагал, что осад ок, полу че н н ы й фр а к ц и о н н ым ос аж д е н и ем над ог.ад очного с лоя ку льтурного бульона штаммов фазы I Bordetella pert ussis с использованием сульфата аммония рас творяетс я в смес и 1 М рас твора х лорис того натрия и 0,05 М фос фатного бу фера, ацетат кальция добавляю т до конечной концентрации 0, 01-1,0 вес/ об. %, пред почтительно 0, 2-0,0 оес/ об.%, гфи рН 6, 5-9 и полученной с мес и д ают пос тепенно реагировать в температурном интервале 4°С - комнатная текпераі ура в течение времени от 20 мин до 2 ч с получением кальций фос фатного геля. Пос ле такой реакции полученный в резу льтате осадок удаляют таким извес тным per se методом, как фильтрация или центрифугирование. Соглас но такой методике можно селективно уд алить 90-99, 9% эндотокс ина без заметной потери защитной фракции. Полу очищенный продукт, полу ченный выше, д алее под вергают земельному центрифу гированию, пред почтительно, пос ле дополнительного концентрирования выс аливанием с помощью сульфата аммония (фракционное осажд ение). Метод зонального центрифугирования соглас но изобретению может представлять собой сахароза-град иентное центрифугирование, калий тартратное центрифугирование под д ейс твием силы тяжес ти, цезий хлорид ное градиентное центрифу гирование и т.п., хотя особенно предпоч тительным метод ом является с ах арозо-грод иентиое цент рифугирование. Обычные условия сзхароза-град иенті. ого центри фу гирования: 12647 град иен т пл о тнос ти: 0-3 0 пес . / вес . % ; IW c: примерно 60. 000-122.000 С; время: примерно 10—2-1 ч. В cooTBGTCTDiui с настоящ им изобретением, получ енную таким образом жидк ос ть, 5 сод ержащую антиин фек цыоииу ю Фракцию пергу зиса подвергают д етокс ификации с помощью формальдегида, глутарового альдегида, пировиноградного апьд егид а и т. п. пос ле чего избыток формальд егид а, глу тарового 10 альд егида, лнровиноградного альдегида или т.п. удаляют такими per se извес тными методами, как д иализ, центрифу гирование или ультрафильтрация и т.д, с получением токсо-ида пертузисэ. Рекомендованная метод ика 15 детоксификации, о соответс твии с опубликованным японским патентом N? 57-50925, заключаетс я о д обавлении формальд егид а к пертузис экэ отокс пн-с од ержзщ ей жидкос ти вколичес твеО,1-0, 6об./ об.% припрактиче- 20 ском отсутс твии (т.е. не более 10 мМ) основных амин ок ис ло т ( нап рим ер, 1- лпз ина, г лицина и т. п. ), инку бировании с мес и при темпера ту ре 32-42°С и течение 3-14 д н с тем, чтобы вызвать флоку ляцию, рэзруш е- 25 нии выпавш его х лопь ями токс оид а с помощью подх од ящ их с редс тв (например, возд ейс твием ультразвука с час тотой 10-15 килоциклов) и суспенд ировапии его в соответс тву ющ ей вод ной с ред е (н апр имер, 30 М/ 100-М/ 250 фос фа тном бу ферн ом рас творе) с получением токс оид пой жидкос ти. D соответс твии с нас тоящим изобрзтеми-ем D резу льтате может Сьпь получен токсоид пертузиса с содержанием эндотоксина, в рас - 35 чете на 10 мкг протеинового азота, но более 0,3 нг, пред поч тительно, не более 0,1 иг соглас но лиму лус лизатпому тес ту. Дру гими словами степень удаления э ндотокс ина мо-же т быть у лучш ена д о значения не менее 40 99,9^9-1%, или предпочтительно, по крайней мере 09,9938%. Токс оид пертузиса с оглас но нас тоящ ему изобретению может быть превращен х орош о извес тными методами в ос ажденную 45 пертузиспу ю вакцину или ос ажд енную пертузис-дифтерия-с толбмяч нуга тройную оак цину , пред назначенну ю д ля вакцинации людей. На фиг. 1 и 2 показаны профили сахаро- 50 за-град иентного центри фугирования кальций фос фа тной г елевой г ру ппы и контрольной гру ппы, с оответс твенно, с огласно примеру 1. П р и м е р . Предс тавлснмыо ниж е спра- 55 сочные и рабочие примеры приведены лиш ^ в целях иллюс трации І; , іе ограничивают с феру изобретения. Свойс тва іш амма B e dc ic lia poit uss is Тохама фазы 1, используемого в.следующих ниже примерах и справочных примерах описаны, например, о Infect ion and Immunit y 6.890 (1972). Такой штамм хранится в Национальном инс титу те зд оровья, Токио, Япония (NIHJ) и депонирован также и Инс титу те ферментации, Осака, Япония под каталожным номером IFO 14073 от 13 августа 1980 г. С пр ав оч н ы й пр и м ер 1. Шта мм Eordet elt a pertuss is Тох ама фазы 1 (IFO 11073) нноку лировали па с реду Борд етаГенгоу, приготовленную из картофеля, пептона, х лорис того натрия, агара и корооьей крови и инку бировали при 35°С в течение 2 дм. Затем отбирали полупрозрачные кругосыа колонии и од ну из них, реагирующую \\а К агглютиимновое антитело, с нова рас пределяли на сред о Бордет-Генгоус целыо приготовления посевной культуры. Затем такую пос евну ю ку льтуру транс плантировали в бу льонную среду Коген-Вилера и сис тему инкубировали в течение 1 дм при 35°С. Полученную в резу льтате бактериальную суспензию д обавля ли в бу льонну ю с ред у Стайнерл-Шолте до конечной концентрации 1 миллиард клеток/мл и в склянк е Р аух а в течение 5 д ней провод или инку бацию при 35°С. Ьыросшие в культурном бу льоне клетки собирали и о верхний слой добавляли 20 ізес./об.% сульфата аммония. После тщательного перемешивания полученную смесь сыстаиоали при 4°С. Примерно через 14 дн смесь центрифугировали, верхний с лой отбрасывали и собирали осадок. Затем к такому осадку добавляли 1/10 объема, в расчете на собранный рас твор, смеси 1М хлорис того натрия и 0,05М фос фатного бу фера (рН 8,0) и полученную смесь тщательно перемеш ивали и выс таивали при 4°С в течение А дн. Затем смесь снова центрифугировали и собирали верх ний над ос адочный с лой (экстракт I). Этотэксгракт 1 обогащен защитной фрак цией, содержащ ей нитевидный гемаггІІ'З ТИНИН (FHA) и токсин пертузиса (Р Т), а также э ндотоксин, но при э том не сод ержит клеток. К аликнотам такого экс тракта 1 пос тепенно д обавляли ацетат кальция д о конеч ных концентраций 0, 2, 0, 4, 0. 6, 0, 8 и 1, 0 вес. /об.% и каждую смесь ос торожно перемешивали при комнатной температу ре в течение 1 ч. Затем полученный в резу льтате осадок отфильтровывали с помощью фильтровальной бумаги с образованием верхнего над ос адочного с лоя. Ис пользуя кажд ый из полученных таким образом над осад очных слоев определяли титр гемагглютинина(РА), содержание Р Т и сод ержание ЬТ. Полученные резуль таты прєдетєзлень ї в табл. 1. Содержание РТ определили методом EL ISA, a содержание Е Т опред еляли лимулус-лизат 12647 ным метод ом (набор Маллинкрод та), использу я в'качес тве с тандарта э ндотокс ин Е.соИСДифко055-В 5). Из табл. 1 следует, что Е Т можно с елективно удалить пу тем введения в сис тему соли кальция в прису тс твии избытка ионов фос фата и отд еления полученного осадка. Более того, D результате добавления 0,2-0,6 вес./об.% ацетата кальция можно уд алить около 99% Е Т, не теряя при э том защитной фракции (НА титр и сод ержание Р Т). Справочный пример 2. Повторяли методику, опис анную в справочном примере 1, за исключением того, что рН устанавливали равным 5, 0-10,0 с помощью гид роксид а натрия или хлористоводородной кислоты, а количес тво д обавленного ацетата кальция составляло 0, 5 вес./об.%. Полученные результаты предс тавлены в таблице 2. Начиная со значения рМ 6,0 происходило желатини рооаиие и степень удаления эидогокс ина у величивалась с повыш ением значения рН. Из таблицы 2 следует, чго оптимальное значение рН 7-9. Справочный пример 3. Повторяли методику, опис анную в справочном примере 2, за ис к люч ен ие м тог о, ч то в мес то 0, 5 вес./об.% ацетага кальция использовали 5 вес./ об.% ш дрокс илапатинз (БДН). Полученные результаты представлены а табл. 3. Из табл. 3 с ледует, ч то по сравнению с добавлением ацетата кальция для образования кальций фос фатных гелей внутри рас твора, введение гид роксилапотина привод ит к менее э ффективному удалению эндотоксина и обеспечивает обращение упомянутой выше зависимос ти от значений рН. П р и м е р і , Каждый экс трак т 1 (к онтрольная группа), полученный по метод ике, описанной в справочном примере 1, и материал, полученный д обавлением ацетата кальция к экс тракту 1 до конечной концентрации 0.5 с ое./ об. % и пос ледующей обрабо тк ой с м ес и с ог лас н о оп ис ан но му в справочном примере 1, смешивали с рапным объемом насыщенного йодного рас твора су льфата аммония и полученную смесь еыс таиБзли с точение 7 дп при Л°С. Осажденный сульфатом материал центрифугировали при скорос ти вращения 10000 об/мин, а течение 20 мин и собирали осадок. Затем добавляли 1/300 объема, в расчете па объем рас твора с мес и Ш х лорис того натрия и 0.05М фос фатного бу фера (pll 8,0). После тщательного перемешивания смесь подвергали д иализу в трубке с использооанисм в качестве внешней среды Ш рас таора хлористого натрия (рН 8, 0). Диализат подвергали сах ароза-град иент пому центрифугированию в с ледующ их условиях; град иент плот 8 ности сахарозы = 1-30 вес./вес.%, Нмакс " 694001G и время - около 18 часов. Загрузка в случае группы кальций фос фатного желатинирования вдвое превышала загрузку 5 контрольной группы. После центрифугирования, в ротор сводили 34 вес./пес. % раствор с ах арозы с целью осущ ес твления фракционного сбора. В кажд ой собранной таким образом фракции опред еляли содер10 ж ание FHA с помощ ью методик и ELIS A it содержание Р Т и Е Т с помощью метод а, опис анного в справочном примере 1. Полу ченные результаты представлены на фиг. 1 и 2. На э тих рисунках содержание FHA, Р Т 15 и Е Т обозначены символами -0-, -Д- и - Ш -, соответственно. Из данных, представленных на фиг. 1 и 2, следует, что, несмотря на удвоенные загрузки, группа кальций фос фатного желати20 нироваиия обес печ ивает более дискретное отделение защитной фракции (FMA, РТ) о т эндотоксина, чем э то имеет мес то в контрольной группе. В каждой из кальций фос фатных и кои25 трольных групп собирали фракции с дефицитом ЕТ и обогащенные FHA и содержание протеинового азота устанавливали равным примерно 50 мкг/мл. К ним добавляли 0,02 оес/об. % желатины, 0, 05 вес/ об.%. Твипа 30 80 и 0,4 об./об.% формальдегид а и полученные смеси инкубировали ь течение нескольких дней при 39°С. Получению в результате токсоид ную жидкос ть д иализировалн и оп ределяли в ней содержание ЕТ, Полученные 35 резу льтаты приведены в таблице 4. Содержание ЕТ определяли лимулус-лизатным тестом (набор Вако Пьюэ Кзмикл), используя в качество стандарта эндотоксин Е.соН. (Дифко 055-(35). 40 Как следует из данных, предс тавленных , в таблице 4, в сравнении с содержанием £Т о основной жидкос ти токс оид а пертузисаиа вакцинном уровне (с од ержание протеинового азота 10 мкг/ мл), с од ержание Е Т в 45 группе кальций фос фатного желатинирования улучш ено до величины менее 1/ 10 от значения в контрольной гру ппе. П р и м е р 2. В с оответс твии с оригинальным метод ом Левина (Р ео Левин, Джо50 зеф Л. Стоу н, Льюиз Б. Виман: Факторы, оказывающие влияние на э ффективнос ть алюминиевой присадки к токсопдам д ифтерии и с толбняка. J.Immunology 75, 301-307, 1955), каждую из двух партий основной жпд55 кос ти токсоида перт/ зис а разбавляли фосфатным бу ферным рас твором М/250 (рН 7,0) с получением с од ержания протеинового азота 10 мкг/мл, пос ле чего д обавляли хлорис тый алюминий д о конеч ной концентраци и 0, 1 8 вес / о б. % . По лу ч е нну ю с мес ь 12647 10 или менее; увеличение чис ла лейкоцитов у мышей: 0,5 {.Р У/мл или менее; чувствительнос ть к гис тамипу у мышей: 0,8 НБУ/мл или менее; мощнос ть токс оид а перту зис а: 8 IY/мл или более. Таким образом, обе партии у д овлетворяю т с танд артным значениям, указанным п Станд арте на биологические продукты. тщательно перемешивали и устанавливали рН 7,0 с помощью хлорис товодород ной кислоты или гид рокс ида натрия с целью приготовле ния 0, 2 мг/ л ад с орбированн ой на алюминии вакцины. Основные свойс тва такой вакцины: рН 7,0, пирогенмос ть на кроликах: отрицательная, умешшение веса мышей: 10 В\А/ДУ/мл Та& лица 1 Количес тво добавленного ацетата кальция (вес / об. % ) Содержание он* лотокемно (нг/мл) 0 87800 0.2 0.4 0,6 0.8 1,0 ., Титр НЛ * (НА и/ мл) 1220 1100 1400 1200 400 200 98,2 98,9 90,2 99,9 99,9 Содержание Р Т (Е и/ мл) 1200 1013 960 720 73 20 Удаление эндотокс ина, % 1140 1400 1080 І210 1030 .ill А Титу> ИЛ мреимущесюенно отражает содержание FHA. Таб лица 2 Содержание эндотоксина (нг/мп) 33-1000 1СГ,000 103000 53000 24000 220Q0 18000 26С0ОО Удаление эндотоксина (%) 41,6 67,7 84,1 92,8 93,4 94,6 19,8 Титр НА* (НАи/мл) 3000 2700 3000 3000 3000 3200 3000 3000 Таблица 3 РН (до обработки) Содержание эндоток- Удаление эндотоксина сина (нг/ мл) (%) 334000 Титр НА * (НА и/ мл) 3000 6,0 52,1 3000 195000 41,6 3000 8,0 100000 7,0 2G4000 21,0 3000 9,0 294000 12,0 3000 11 12647 12 Таблица 4 Группа Са-фос фатного желатинирова Контрольная группа ния Содержание эндо- Удаление эндоток- Содержание эндо- Удаление эндотоктоксина токсина сина 0, 3 нг/ мл Пример 1 сина 99,99994% 19, 0 нг/мл 99,99591% (0, 6 нг/мл) Пример 2 0, 3 нг/ мл (3, 8 нг/ мл) 99,99988% (0, 06 нг/ мл) 12, 8 нг/ мл 99,99458% (2, 6 нг/ мл) * Значение в скобках означает сод ержание э ндотокс ина на 10 г/мл протеинового азота. Упорядник Замовлення 4076 Техред М.Моргентал Коректор М. Самборська Тираж Підписне Державне патентне від омс тво України, 254655, ГСП. КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товарис тво "Патент", м. Ужгород, ву л.Гаг арІна, 101