Спосіб отримання рістстимулювального фітогормонального препарату для рослин

1. Спосіб отримання фітогормонального препарату, що передбачає культивування мікроорганізма-продуцента у рідкому поживному середовищі, який відрізняється тим, що як мікроорганізмпродуцент використовують азотфіксувальний високоефективний штам мікросимбіонтів сої Bradyrhizobium japonicum. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що азотфіксувальний високоефективний штам мікросимбіонтів сої Bradyrhizobium japonicum є вибраним з групи, що включає Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6018 та Bradyrhizobium japonicum УКМ В-6035. (19) (21) u201011838 (22) 06.10.2010 (24) 26.04.2011 (46) 26.04.2011, Бюл.№ 8, 2011 р. (72) ДРАГОВОЗ ІГОР ВОЛОДИМИРОВИЧ, ЛЕОНОВА НАТАЛІЯ ОСИПІВНА, БІЛЯВСЬКА ЛЮДМИЛА ОЛЕКСІЇВНА, ІУТИНСЬКА ГАЛИНА ОЛЕКСАНДРІВНА, ЯВОРСЬКА ВІКТОРІЯ КАЗИМИРІВНА (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ, ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ НАЦІОНАЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ НАУК УКРАЇНИ 3 передбачають культивування зазначених штамів на рідкому поживному середовищі, відокремлення біомаси грибів від культуральної рідини шляхом центрифугування та етанольну екстракцію отриманого фільтрату. Основним недоліком описаного способу є вузький спектр фітогормонів в кінцевому продукті та невисокий рівень їх вмісту, що також обмежує можливості його використання. Найближчим аналогом до запропонованого способу є заявка на винахід № а200901173 (дата подання 13.02.2009). У запропонованій заявці описується застосування штаму Streptomyces avermitilis IMB Ас-5015 для отримання фітогормонів. При цьому зазначений штам вирощують у рідкому середовищі методом глибинного культивування, після чого здійснюють етанольну екстракцію фітогормональних сполук з попередньо осадженої біомаси мікроорганізмів. Зазначений спосіб забезпечує отримання ауксинів, цитокінінів та абсцизової кислоти. Недоліком використання вказаного штаму у способі отримання фітогормональних сполук є багатоетапність здійснення способу, що зумовлює значні втрати та відносно низький вихід кінцевого продукту. Задача запропонованої корисної моделі полягає у спрощенні способу отримання фітогормональних сполук, що не вимагає проведення етанольної екстракції, при одночасному забезпеченні отримання широкого спектру фітогормональних сполук з рістстимулювальною активністю. Вирішення вказаної задачі забезпечується за рахунок культивування мікроорганізмівпродуцентів, а саме високоефективних азотфіксувальних штамів мікросимбіонтів сої В. japonicum, на стандартному рідкому середовищі для культивування бульбочкових бактерій. При цьому у переважному втіленні корисної моделі використовують високоефективні азотфіксувальні штами В. japonicum УКМ В-6018 та УКМ В-6035. Під високоефективними азотфіксувальними штамами розуміють такі, що характеризуються високою нодуляційною активністю, високою симбіотичною ефективністю (маса бульбочок, надземна та коренева маса), високою нітрогеназною активністю у симбіозі та високою конкурентоздатністю стосовно інших мікроорганізмів. Авторами заявленої корисної моделі було несподівано виявлено, що високоефективні азотфіксувальні штами мікросимбіонтів сої В. japonicum, на відміну від малоефективних штамів того самого виду, володіють здатність до ефективного синтезу широкого спектру фітогормонів (ауксинів, цитокінінів гіберелінів та абсцизової кислоти) у вигляді екзометаболітів, що дає змогу використовувати культуральне середовище мікросимбіонтів як рістстимулювальний препарат для рослин без обов'язкового здійснення процедури етанольної екстракції фітогормональних сполук. Фізико-хімічний аналіз фітогормональних сполук, які виділялися в поживне середовище в процесі культивування штамів В. japonicum, показав переважаючу кількість сполук, які є рістстимуляторними фітогормонами, зокрема, ауксинової природи - індолілоцтової кислоти та індол-3карбоксилової кислоти, цитокінінової природи 58822 4 зеатинрибозиду, ізопентиладенозину рибозильованого, зеатину, ізопентеніладеніну та гіберелової кислоти. Було продемонстровано, що зазначені штами В. japonicum переважно синтезують фітогормональні сполуки у вигляді екзометаболітів у культуральне середовище, у той час, як вміст зазначених фітогормонів у самих бактеріальних клітинах є невисоким і коливається у межах від 0,004 до 2,0 мкг/г абсолютно сухої біомаси. Це, ймовірно, пов'язано з тим, що вказані фітогормони не відіграють суттєвої регуляторної та фізіологічної ролі у самих бактеріальних клітинах. Варто зазначити високу здатність високоефективних штамів В. japonicum до синтезу зеатинрибозиду, який є транспортною формою цитокінінів, що, ймовірно, має певну фізіологічну доцільність при взаємодії з рослиною-господарем, оскільки відомо, що рибозилювання є одним із способів інактивації цитокінінів у рослинах, при цьому їх фізіологічна активність дуже низька або повністю відсутня. І саме в такий спосіб регулюється пул ендогенних фізіологічно активних цитокінінів в рослинних тканинах. Використані для досліду штами високоефективних мікросимбіонтів (високоефективні штами, що формують на коренях активний азотфіксувальний апарат) сої В. japonicum УKM В-6018 та УКМ В-6035 отримані з колекції відділу загальної та ґрунтової мікробіології Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ. Для порівняння використовували малоефективний штам В. japonicum 21110 (отриманий з колекції Всеросійського науково-дослідного інституту сільськогосподарської мікробіології Російської академії сільськогосподарських наук (Санкт-Петербург, Пушкін)), а також активні штами вільноіснуючих діазотрофів селекції IMB НАНУ: Azotobacter chroococcum УКМ6003 та A. chroococcum УКМ-6082. Запропоновані для порівняння штами виявили низьку здатність до синтезу фітогормонів у порівнянні із дослідженими штамами В. japonicum. Таким чином, можна зробити висновок, що біологічна активність симбіотичних бактерій, зокрема, високоефективних штамів роду Bradyrhizobium, корелює з їх підвищеною здатністю до синтезу гормонів ауксинової та цитокінінової природи. Якісне та кількісне визначення фітогормонів різних класів проводили методом спектроденситометричної тонкошарової хроматографії [Савинський С.В., Кофман И.Ш., Кофанов В.И., Стасевская И.П. Методические подходы к определению фитогормонов с помощью спектроденситометрической тонкослойной хроматографии // Физиол. и биохим. культ раст. - 1987.- т. 19, № 2.- с. 210-215]. Використаний у корисній моделі азотфіксувальний штам В. japonicum УКМ В-6035 (UA 3324, опубл. 27.12.1994) характеризується наступними культурально-морфологічними та фізіологобіохімічними ознаками: клітини 5-7 добової культури мають паличковидну форму розміром 0,3 мкм у ширину та 1,3 мкм у довжину. Клітини рухомі завдяки наявності полярного джгутика (монотрих). Культура грамнегативна, спор не утворює. Облігатний аероб. При посіві штрихом на агаризоване горохове середовище з глюкозою або манітом ріст 5 бактерій слабкий, штрих білуватий слизистий. За фізіологічними властивостями штам відноситься до повільнорослих бульбочкових бактерій, колонії з'являються на поверхні агару на 7-8-у добу. Мають округлу форму, випуклі, блискучі, слизисті, в діаметрі - 1,0-1,2 мм. Біля колоній на поверхні агару може утворюватись райдужний ореол. Культура пігментів не утворює, молоко з лакмусом підлуговує, не пептонізуючи, желатину не розріджує. На середовищах з органічним азотом (МПА) штам не росте, але добре розвивається на поживних середовищах із солями амонію. Штам має активну нітратредуктазу і відновлює нітрати, засвоює глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маніт, дульцит. Крохмаль не гідролізує. Сахарозу засвоює слабко. Штам має гідрогеназу (Нuр+) і частково реутилізує енергію водню, який виділяється при симбіотичній азотфіксації у бульбочках сої. Штам не чутливий до антибактеріальної дії екстрактивних речовин з оболонок насіння ряду сортів сої. Характеризується пектиназною активністю та стійкістю до умов недостатнього зволоження та хлоридносульфатного засолення ґрунтів в інтервалі від 0,1 до 3,0 %. Витримує забруднення важкими металами: Рb2+ - до 30 ГДК; Cd2+, Cu2+, Zn2+ - 10 ГДК, а їх сумішшю - 5 ГДК. Температурний інтервал росту штаму УКМ В6035 - від 18 до 36 °С, температурний оптимум – 26-28 °С. Ріст бактерій спостерігається в діапазоні рН від 4,5 до 8,5. Оптимум рН - 6,5-7,5. Ознаки штаму стійкі. Він не патогенний. Культуру зберігають на манітно-дріжджовому агарі, або на бобовому агарі з манітом чи глюкозою при температурі 46 °С, пересіваючи 1 раз в 6 місяців. Штам утворює на коренях сої активні бульбочки. Випробовувався на 5 сортах сої протягом 4 років. Підвищує урожай зерна сої на 2-5 ц/га. Захищений Патентом України № 3324. Продукти, що синтезуються штамом - амоній з азоту повітря в симбіозі з хазяїном, рістстимулювальні речовини типу фітогормонів, вітаміни групи В та органічні кислоти. Штам високоефективний, технологічний. Генетичні особливості штаму - прототроф, чутливий до антибіотиків. При культивуванні фаголізису не виявлено. Використаний у корисній моделі азотфіксувальний штам В. japonicum УКМ В-6018 характеризується наступними культурально-морфологічними та фізіолого-біохімічними ознаками: клітини 5-7добової культури штаму УКМ В-6018 мають паличковидну форму розміром 0,6-0,8 мкм в ширину та 1,2-3,0 мкм в довжину. Клітини рухомі завдяки наявності полярного джгутика (монотрих). Культура грамнегативна, спор не утворює. Облігатний аероб. При посіві штрихом на агаризоване горохове середовище з глюкозою або з манітом ріст бактерій слабкий, штрих білуватий слизистий. За фізіологічними властивостями штам відноситься до повільнорослих бульбочкових бактерій, колонії з'являються на поверхні агару на 7-8-у добу. Вони мають округлу форму, опуклі, блискучі, слизисті, в діаметрі 1-1,2 мм. Біля колоній на по 58822 6 верхні агару може утворюватись райдужний ореол. Культура пігментів не утворює, молоко з лакмусом підлуговує, не пептонізуючи, желатину не розріджує. На середовищах з органічним азотом (МПА) штам не росте, але добре розвивається на поживних середовищах із солями амонію. Штам має активну нітратредуктазу і відновлює нітрати, засвоює глюкозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маніт, дульцит. Крохмаль не гідролізує. Сахарозу засвоює слабко. Штам не чутливий до антибактеріальної дії екстрактивних речовин з оболонок насіння ряду сортів сої. Характеризується пектиназною активністю та стійкістю до умов недостатнього зволоження. Витримує забруднення важкими металами: Рb2+ - до 30 ГДК; Cd2+, Cu2+, Zn2+ - 10-20 ГДК, а їх сумішшю - 7 ГДК. Температурний інтервал росту штаму УКМ В6018 - від 18 до 36 °С, температурний оптимум 26-28 °С. Ріст бактерій спостерігається в діапазоні рН від 4,7 до 8,5. Оптимум рН - 6,5-7,5. Ознаки штаму стійкі. Він не патогенний для теплокровних. Культуру зберігають на манітно-дріжджовому агарі, або на бобовому агарі з манітом чи глюкозою при температурі 4-6 °С, пересіваючи 1 раз в 6 місяців. Штам утворює активні бульбочки на різних сортах сої. В порівнянні з еталоном дає прибавки урожаю зерна на рівні 6-15 % при одночасному збільшенні вмісту білку в урожаї на 15-27 %. Продукти, що синтезуються штамом - амоній з азоту повітря в симбіозі з хазяїном, рістстимулювальні речовини типу фітогормонів, вітаміни групи В та органічні кислоти. Штам високоефективний, технологічний. Генетичні особливості штаму - прототроф, чутливий до антибіотиків. При культивуванні фаголізису не виявлено. Запропонована корисна модель може бути проілюстрована приведеними нижче прикладами. Приклад 1. Отримання культурального середовища штамів Bradyrhizobium japonicum УКМ В6035 та УКМ В-6018 та дослідження його на вміст фітогормонів. Культивування В. japonicum УКМ В-6018 та В. japonicum УКМ В-6035 здійснювали в колбах об'ємом 750 мл в періодичних умовах (при 220 об./хв.) та при температурі 28-30 °С, рН 6,6-7,0 протягом 72-96 годин на рідкому поживному середовищі Ісварана наступного складу(г/л): NaCl - 0,1; К2НРО4 - 0,5; MgSO4·7Н2О-0,2; FeCl3 - 0,01; маніт 10,0; глюконат кальцію - 1,5; дріжджовий екстракт 2,0; рН 7,2. Для порівняння використовували малоефективний штам мікросимбіонтів сої Bradyrhizobium japonicum 21110, а також активні штами вільноіснуючих діазотрофів селекції IMB НАНУ: Azotobacter chroococcum УКМ-6003 та A. chroococcum УКМ-6082. Отримане в результаті культивування середовище в подальшому аналізували на вміст фітогормональних сполук фізико-хімічним методом. Дані наведені у Таблиці 1. 7 58822 8 Таблиця 1 Питоме продукування ауксинів, цитокінінів та АБК у культуральне середовище бульбочковими бактеріями роду Bradyrhizobium japonicum та вільноіснуючими діазотрофами Azotobacter chroococcum Фітогормони IOК Індол-3Ауксини карбоксилова кислота Зеатинрибозид Ізопентеніладенозин рибозиЦитокініни льований Зеатин Ізопентеніл-аденін Абсцизова кислота Питоме продукування фітогормонів у культуральне середовище мкг/г абсолютно сухої біомаси В. japoniсum В. japoniсum В. japoniсum A.chrooсоссum A.chrooсоссum УКМВ-6018 УКМ В-6035 21110 УКМВ-6003 УКМВ-6082 772,76