Спосіб одержання лектину бруслини європейської (euonymus europaea l.)

Спосіб одержання лектину бруслини європейської (Euonymus europaea L.), що включає екстра 3 59331 Перевагами запропонованого способу одержання лектину є те, що його здійснюють з кори рослини у будь-яку пору року, що розширює календарні терміни збору сировини, без стадії знежирення та без використання при екстракції 1,3-диамінопропану та гель-хроматографії, що зменшує кількість стадій очищення. Окрім цього, проведення афінної хроматографії на поперечнозшитому овомуцині здешевлює процес одержання лектину. Запропонована корисна модель ілюструється фігурами. На Фіг. 1 відображено електрофорез лектину кори бруслини в 15 % ПААГ з 0,1 % додецилсульфатом натрію (ДЦС-натрію), рН 8,6, одержаний за описаним способом, де R - положення білків-маркерів, 1 - очищений лектин кори. На Фіг. 2 відображено електрофорез лектину арилусів насіння бруслини в 15 % ПААГ з 0,1 % ДДСнатрію, рН 8,6, одержаний за прототипом, де R положення білків-маркерів, 1 - неочищений естракт, 2 - очищений лектин ариллусів насіння бруслини європейської. На Фіг. 3 та Фіг. 4 наведено приклади застосування міченого пероксидазою лектину кори (Фіг. 3) та арилусів насіння (Фіг. 4) бруслини європейської при фарбуванні гістологічних зрізів, зокрема, поперечного зрізу ендоментрію матки щура (збільшення 40x8). Спосіб одержання лектину бруслини європейської здійснюють таким чином. Зібрану кору бруслини європейської у будь-яку пору року (200 г) подрібнюють до розмірів частинок діаметром менше 0,5 мм, потім поміщають у посудину з мішалкою, заливають 0,9-1 % розчином хлориду натрію або 0,1-0, 5 М буферним розчином з рН 5,0-8,0 і перемішують не менше 60 хв. у співвідношенні кора : екстрагент 1:8-10. Одержаний екстракт освітлюють центрифугуванням 10 хв. при 2000 - 5000 g. Лектин з екстракту концентрують шляхом осадження хлоридом натрію при майже повному насиченні солі (300 г/л). Осад, що містить лектин, збирають центрифугуванням 20 хв. при 8000 g або фільтруванням. Далі осад розчиняють у воді і ставлять на діаліз проти водопровідної води. Утворений незначний осад видаляють, розчин фільтрують і наносять на колонку ДЕАЕ-Tojoреаrl, урівноважену 0,05 М фосфатним буфером, рН 7,0. Колонку промивають цим же буферним розчином, а далі збільшують іонну силу розчину до 0,2 М. Вихід лектину з колонки контролюють за допомогою реакції гемаглютинації еритроцитів людини групи В(III) або О (І). Лектин виходить з колонки в діапазоні 4 0,2-0,3 М фосфатного буферного розчину, рН 7,0. Фракції, що містять гемаглютинуючу активність, об'єднують, і очищений летин висолюють 300 г/л хлоридом натрію. Утворений осад центрифугують, розчиняють в невеликому об'ємі води і після короткого діалізу (2-3 год.) проти дистильованої води наносять на промиту 1 М хлоридом натрію колонку, заповнену афінним сорбентом. В якості афінного сорбенту використовують поперечнозшитий овомуцин, виготовлений за відомим способом [4]. Після входження розчину лектину в гель останній промивають від баластних білків 1 М розчином хлориду натрію. Сорбований на колонці лектин знімають за допомогою 0,1 М боратного буферного розчину, рН 9,0-9,8, нагрітого до температури +30 - +55 °С. Необхідність застосування нагрітого буферного розчину з рН 9,0-9,8 обумовлена сильною сорбцією лектину на афінному сорбенті. При нагріванні буферного розчину забезпечується більш швидка і концентрована елюція лектину з афінного сорбенту. Вихід лектину з колонки контролюють по білку методом Лоурі або на спектрофотометрі при 280 нм. Фракції, що містять білок, об'єднують, лектин висолюють хлоридом натрію або сульфатом амонію. Одержаний лектин зберігають у висоленому стані або після вичерпного діалізу проти дистильованої води ліофільно висушують. Докази ідентичності лектину кори і лектину арилусів насіння бруслини європейської. Лектин кори і лектин арилусів насіння бруслини європейської показує однакові фізико-хімічні та імунобіологічні властивості. Про це свідчать дані електрофорезу в ПААГ в денатуруючих умовах (0,1 % ДДС-натрію), дані по дослідженню взаємодії з еритроцитами людини та тварин (табл. 1), дослідження вуглеводної (табл. 2) та гістохімічної специфічності цих лектинів. Електрофорез очищеного препарату лектину кори бруслини європейської, одержаного за даним способом, представлений на фіг. 1 та електрофорез лектину арилусів насіння бруслини європейської представлений на фіг. 2. В обох випадках використано 15 %-вий ПААГ, тріс-НСl буферний розчин, рН 8,6, за присутності 0,1 % ДДСнатрію (де R - розміщення стандартної суміші білків-маркерів відомої молекулярної маси). Положення субодиниць очищеного лектину кори (лінія 1 на фіг. 1) та лектину арилусів насіння (лінія 2 на фіг. 2) вказує, що їх молекулярна маса є однаковою і рівною 17 кДа. Таблиця 1 Дослідження взаємодії лектинів кори та насіння Е. europaeus з еритроцитами людини та тварин № п/п 1 2 3 4 5 Тип еритроцитів Людина, I (0) Людина, II (А) Людина III (В) Кролик Собака Джерело одерлсання лектину Лектин кори Лектин насіння -11 -11 2 2 -8 -8 2 2 -11 -11 2 2 -15 -15 2 2 -13 -13 2 2 5 59331 6 Продовження таблиці 1 6 7 8 9 10 11 -8 Щур Миша Морська свинка Короп Качка Курка 2 -3 2 -8 2 -3 2 Примітка: титр гемаглютинації (найбільше розведення, при якому спостерігається аглютинація) в -8 таблиці представлений у вигляді показника степеня, наприклад, 2 =1:256. Таблиця 2 Порівняльне дослідження вуглеводної специфічності лектинів кори та арилусів насіння бруслини європейської № п/п 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Вуглевод D-глюкоза D-галактоза Мальтоза Лактоза Сахароза -метил-D-галактопіранозид -метил-D-галактопіранозид -метил-D-манопіранозид Оваріомуцин Н Оваріомуцин А Оваріомуцин В -феніл-N-ацетил-О-глюкозамін L-рамноза Салівомуцин бика N-ацетил-D-галактозамін N-ацетил-D-глюкозамін Трансферин 1 % Тиреоглобулін бика IgG людини Дріжджевий макан L-фукоза L-ароабіноза Ристоміцин 4-нітрофеніл--D-глюкопіранозид 4-нітрофеніл--D-манопіранозид -феніл-N-ацетил-D-глюкопіранозид Целобіоза Глікоген печінки свині Овомукоїд Порівняльне гістохімічне дослідження зв'язування лектинів кори та арилусів насіння бруслини європейської з глікокон'югатами тканин ссавців було здійснене за допомогою мічених пероксидазою хрону лектинів, виготовлених за раніше описаною методикою [5], на ендометрії щурів - самок лінії Wistar у діестральній фазі статевого циклу. Фіксація гістологічного матеріалу здійснювалась у 4 % нейтральному формаліні з наступною заливкою у парафін для виготовлення зрізів товщиною 5-7 мкм. Візуалізація рецепторів Мінімальна конц. вуглеводу (в мМ) або глікопротеїну, що пригнічує активність 4 гемаглютинуючих одиниць лектину Лектин кори Лектин арилусів насіння 50 50 0,03 % 0,03 % 0,125 % 0,125 % 0,004 % 0,004 % 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 40 мМ 40 мМ 1% 1% лектинів проводилась 3,3'-діамінобензидином тетрагідрохлоридом в присутності перекису водню. Для обох лектинів (кори та арилусів насіння бруслини європейської), мічених пероксидазою у гістологічних зрізах ендометрію спостерігалось зв'язування лектинів у наступних структурах: поверхневому епітелії та епітелії залоз (апікальній частині клітин), лейкоцитах, розташованих у власній пластинці слизової оболонки, волокнистих структурах, особливо периферійних ділянок 7 ендометрію, а також у цитоплазмі децидуальних клітин. Лейкоцити і волокнисті структури давали більш інтенсивну позитивну реакцію, порівняно із поверхневим епітелієм, епітелієм залоз, а також децидуальними клітинами (фіг. 3 та фіг. 4). Таким чином, порівняльне дослідження лектинів кори та арилусів насіння бруслини європейської, здійснене за допомогою електрофорезу в 15 % ПААГ за присутності 0,1 % ДДСнатрію, дослідження вуглеводної специфічності, взаємодії з еритроцитами людини та тварин, а також гістохімічної специфічності, проведене на прикладі ендометрію матки щура, свідчить про ідентичність обох лектинів. Джерела інформації: 1. Pacak F., Kocourek J. Phytohemagglutinins XXV. Isolation and characterization of hem-agglutinin of the spindle tree seeds (Evonymus europaeus). // 59331 8 Biochim. Biophys.Acta. - 1975. -V. 400, No 2. - P. 374-386. 2. Petryniak I., Pereira M.E.A., Kabat E.A. The lectin of Euonymus europaeus: purification, characterization and immunochemical study of its combining site. // Arch. Biochem. Biophys.-1977.-V. 178.-P. 118134. 3. Fouquaert E., Peumans W.J., Smith D.F., Proost P., Savvides S.N., Van Damme E. J.M. The "Old" Euonymus europaeus Agglutinin Represents a Novel Family of Ubiquitous Plant Proteins // Plant Physiology. - 2008.-V. 147. - P. 1316 - 1324. 4. A.c. CPCP № 1554961, МПК В 01 J 20/22, С 12 N 11/00, опубл. 7.04.90 p. Б.И. № 13, 1990. 5. Антонюк В.А., Ященко A.M. Коньюгирование лектинов с пероксидазой хрена: усовершенствование методики // Клиническая лабораторная диагностика. - 1996. - № 3.-С. 51-52. 9 Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 59331 Підписне 10 Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601