Спосіб біологічної утилізації шестивалентного хрому cr(vi)

Реферат: Спосіб біологічної утилізації шестивалентного хрому Cr(VI), що базується на використанні бактерійних клітин. Як штам-очисник використовують Сr(VІ)-стійкий, прототрофний мутант штаму S. sioayensis Lv81, який вирощують у рідкому середовищі SG, яке додатково містить Cr(VI). UA 69352 U (54) СПОСІБ БІОЛОГІЧНОЇ УТИЛІЗАЦІЇ ШЕСТИВАЛЕНТНОГО ХРОМУ Cr(VI) UA 69352 U UA 69352 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетики бактерій та біотехнології і може бути використана для знешкодження високотоксичної сполуки - шестивалентного хрому Cr(VI) - у стічних водах гірничорудної промисловості. Відомий спосіб біологічної утилізації Cr(VI), за яким воду чи ґрунт, забруднені Cr(VI), додають до мінімального поживного середовища, в якому попередньо 1 добу вирощують штам Pseudomonas fluorescens, і далі культивують за наявності Cr(VI) протягом 20 діб [Jeyalakshmi D, Kanmani S. Bioremediation of chromium contaminated soil by Pseudomonas fluorescens and indigenous microorganisms. J Environ Sci Eng.-2008. - Vol. 50. P.1-6]. За цей час штам здатний відновити 0,02мМ Cr(VI). Однак, цей спосіб є довготривалим і дає змогу знешкодити незначні кількості Cr(VI). Він заснований на використанні бактерій роду Pseudomonas, що є умовно-патогенними, і їхнє використання у польових умовах може вимагати додаткових заходів безпеки. Найбільш близьким за технічною суттю - найближчим аналогом, є спосіб біологічної утилізації Cr(VI) за допомогою штаму Streptomyces sp. MS-2, що здатний відновлювати Cr(VI) до нетоксичного тривалентного хрому (Сr(ІІІ)) [Mabrouk Mona Ε. Μ. Statistical optimization of medium components for chromate reduction by halophilic Streptomyces sp. MS-2 /Mona E. M. Mabrouk // African Journal of Microb. Research-2008. - Vol.2. - P.103-109]. Штам Streptomyces sp. MS-2 виділяють із морського осаду. Для утилізації Cr(VI), штам вирощують у рідкому середовищі, яке у 1 л морської води містить: 10 глюкози, 2,5г пептону, 1,0г KNO3; 0,5г MgSO4×7H2O, 0,5г СаСl2 та 0,2г дріжджового екстракту. Після стерилізації, у це ж середовище додають певну кількість калію біхромату та інокулюють штам Streptomyces sp. MS-2. Зміни кількості Cr(VI) у середовищі визначають за допомогою Сr(VІ)-специфічного реагента дифенілкарбазиду. Визначення кількості тривалентного хрому Сr(ІІІ) виконують спектрофотометричним способом. Виміри проводили при довжині хвилі 540 нм. Після 72 годин культивування штам Streptomyces sp. MS-2 відновив 0,38мМ Cr(VI). Проте, використаний у цьому способі штам відновлює невелику кількість Cr(VI). Також, довготривалий пошук актиноміцетів у специфічних екосистемах значно сповільнює сам процес утилізації Cr(VI). Пошук таких актиноміцетів, заснований на складних підходах, не завжди веде до позитивного результату. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб біологічної утилізації Cr(VI) шляхом селекції Сr(VІ)-стійких мутантів Streptomyces sioyaensis Lv81 і їхнього дальшого вирощування у Cr(VI)-вмісному середовищі, що дасть змогу підвищити рівень утилізації Cr(VI) та прискорити сам процес. Поставлена задача вирішується так, що у способі біологічної утилізації шестивалентного хрому Cr(VI), що базується на використанні бактерійних клітин, як штам-очисник використовують Cr(VI)-стійкий, прототрофний мутант штаму S. sioayensis Lv81, який вирощують протягом 240  336 годин у рідкому середовищі SG, яке додатково містить 5  50мМ Cr(VI). Хром належить до групи елементів, які є найбільшими забруднювачами довкілля. Цей елемент потрапляє та накопичується в навколишньому середовищі внаслідок діяльності об'єктів гірничорудної промисловості. Відомо, що хром у довкіллі існує у вигляді двох стабільних окислених формах - тривалентний хром Сr(ІІІ) та шестивалентний хром Cr(VI) [Desjardin V. Utilisation of supernatants of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce chromium toxicity and mobility in contaminated soils / V.Desjardin, R. Bayard, P. Lejeune, R. Gourdon // Water, Air, & Soil Pollution: Focus-2008. - Vol. 3. №3. - P.153-160]. Особливо небезпечним та токсичним для живих організмів є Cr(VI), який добре розчинний у воді та здатний вступати в реакції із нуклеїновими кислотами живих організмів. Натомість Сr(ІІІ), який здебільшого утворюється внаслідок відновлення Cr(VI), є менш токсичним, також Сr(ІІІ) потрібний для нормальної життєдіяльності людини і тварин у зв'язку із його роллю в обміні глюкози та ліпідів. Відновлення Cr(VI) до Сr(ІІІ) сьогодні є найшвидшим способом очищення довкілля від токсичного Cr(VI). Спосіб вилучення Cr(VI) із навколишнього середовища за допомогою хімічних відновлювачів є дорогим та небезпечним. Біологічні способи відновлення Cr(VI) привертають дедалі більшу увагу, оскільки є простими у використанні, дешевими та не здійснюють додаткового негативного екологічного тиску на довкілля [Konovalova V. Chromium (VI) reduction in a membrane bioreactor with immobilized Pseudomonas cells / V. Konovalova G. Dmytrenko, R. Nigmatullin M. Bryk // Enzyme Microbiol. Technol.-2003. - Vol. 33. - P.899-907]. Бактерійне відновлення Cr(VI) на сьогоднішній час є найефективнішим та найдешевшим підходом у його біоутилізації. Відомі різні мікробні агенти, які здатні відновлювати Cr(VI) [Sultan S. Reduction of toxic hexavalent chromium by Ochrobactrum intermedium strain SDCr-5 stimulated by heavy metals / S. Sultan S. Hasnain // Bioresour. Technol.-2007. - Vol.98. - P.340-344., Rajkumar M. Characterizationof a novel Cr6+reducing Pseudomonas sp. with plant growth promoting potential / M. 1 UA 69352 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Rajkumar, R. Nagendran, K. Lee, W. Lee // Curr. Microbiol.-2005. - Vol.50. - P.266-271]. Однак найцінніші бактерії, які здатні до біоутилізації Cr(VI) - актиноміцети, оскільки вони є піонерами у колонізації непридатного до життя ґрунту і беруть активну участь у його рекультивації. Авторами вперше запропоновано використати селекцію прототрофних Сr(VІ)-стійких мутантів актиноміцетів для підвищення біологічної утилізації Cr(VI), оскільки тільки прототрофні мутанти виявляють підвищену хром-редуктазну активність. Для селекції вибрано S. sioyaensis Lv81, тому що цей актиноміцет у вихідному стані виявляє значну хромвідновлювальну активність. Запропонований підхід дасть змогу значно підвищити знешкодження токсичної сполуки у порівнянні з описаними аналогами. Запропонований спосіб простіший за відомі аналоги, оскільки не вимагає трудомісткого скринінгу хромвідновлювальних штамів із важкодоступних природних середовищ та використання складних підходів для ідентифікації та вирощування останніх. Його перевагою є також можливість дальшого підвищення хромвідновлювальної активності мутанта за допомогою селекції на підвищену стійкість до Cr(VI) та прискорення процесу утилізації. Спосіб можна проілюструвати прикладами: Зважування компонентів середовищ виконували на лабораторній вазі Axis BDM 1.5 4-го класу точності. Зважування міліграмових кількостей речовин (біхромату калію, фенілкарбазиду) виконували на аналітичний вазі Mettler-Toledo 2-го класу точності. Відмірювання рідин виконували мірними 1-літровими циліндрами JenaGlass з похибкою 1 %. 8 Спорову суспензію штаму S. sioyaensis (титр спор - 10 ) засівають на чашки Петрі із середовищем MM-S (г/л: K2НРО4-0,5, MgCl27H2O-0,1, FeCl24H2O-0,01, KОН - 0,3, аспарагін 0,5, агар - 17, вода дистильована - до 1, рН до стерилізації 7,0), що містить 20мМ Cr(VI) [Tanaka K, Нао Ζ, Kai Μ, Okayama Η. Establishment and maintenance of sister chromatid cohesion in fission yeast by a unique mechanism / EMBO J. 2001 Oct 15;20(20):5779-5790]. Вирощують протягом 6  7 діб при 28±2 °C. Як джерело Cr(VI) використовують біхромат калію K2СrO4. Вихідний розчин Cr(VI) готують, розчинивши 19,4г K2СrO4 у 100мл дистильованої води. Стерильний розчин Cr(VI) додають до стерильного середовища до кінцевої концентрації 100мМ. Колонії, які виросли, переносять за допомогою стерильних зубочисток на чашки Петрі, які містять вівсяне середовище (г/л: вівсяне борошно - 30, агар - 18, вода водопровідна - до 1л, рН до стерилізації 7,0) та вирощують 6 діб при 28±2 °C для отримання достатньої кількості спор. Після цього, колонії що виросли на середовищі, способом відбитків переносять на чашки із середовищем MM-S для ідентифікації прототрофів і ауксотрофних мутантів штаму S. sioyaensis Lv81. Виділені прототрофи пересівають на чашки Петрі із середовищем MM-S, яке містить 100мМ Cr(VI) і відбирають ті клони, які виявляють стійкість до вказаної кількості Cr(VI) у середовищі. Перевіряють отримані мутанти на стабільність ознаки хром-резистентності шляхом кількох послідовних пересівів на чашки Петрі із середовищем MM-S, що містить 100мМ Cr(VI) та на вівсяне середовище без Cr(VI). Таким способом отримують хром-резистентний мутант №138 штаму S. sioyaensis. Отриманий хром-резистентний мутант №138 вирощують протягом 6 діб при 28±2 °C на чашках Петрі із вівсяним середовищем з метою отримання достатньої кількості спор для визначення Cr(VI) відновного потенціалу отриманого мутанта. Для синхронізації культури мутанта №138, стерильною мікробіологічною петлею переносять частину спор у колби Ерленмейєра з об'ємом колб 50мл, що містять 7 мл стерильного середовища SG (г/л: глюкоза 20, соєвий пептон - 10, вода дистильована - до 1л, рН до стерилізації - 7,0) [Y. Rebets, B.Ostash, A. Luzhetskyy, D.Hoffmeister, A. Brana, C.Mendez, J.A. Salas, A. Bechthold, V. Fedorenko. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus SI36 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.V.222(l).-P.149-153.]. Після інкубації у водяній качалці протягом 48 годин при 28±2 °C, із рідкого ферментаційного середовища відбирають 100мкл біомаси та переносять у колби Ерленмейєра з об'ємом колб 100мл, що містить 15мл стерильного середовища SG1, куди заздалегідь вносять 5  50мМ Cr(VI). Інкубують 14 діб при 28±2 °C у водяній качалці. Оцінюють рівень утилізації Cr(VI) мутантом № 138. На 14 добу росту відбирають 2мл ферментаційного середовища і центрифугують 2хв. при 13тис об/хв. і відбирають 1мл супернатанту у центрифужні пробірки. Кожен досліджуваний зразок, який містить визначену кількість Cr(VI), розводять для отримання 1мМ розчину Cr(VI). Для визначення вмісту залишкового Cr(VI) використовують дифенілкарбазидний спосіб. Перед кожним визначенням готують розчин 0,02 % дифенілкарбазиду. Для цього 10мг дифенілкарбазиду розчиняють у 2мл ацетону або етанолу, і цей розчин доводять до 50 мл підкисленою водою. Підкислену воду готують так: у 50мл води вносять 0,5мл 1М (NH4)2НРО4 або 0,5мл 1М H2SO4. У пробірки спершу додають розчин дифенілкарбазиду - 2,5мл, потім дослідний зразок - 0,05мл, який містить 2 UA 69352 U 5 хромат. Після 10 хв. інкубації, концентрацію Cr(VI) визначають спектрофотометрично на приладі ФЕК-50, при довжині хвилі 540нм у кюветі з шириною ходу - 1см, у порівнянні з контролем розчином дифенілкарбазиду. Для перерахунку концентрації хромату будують калібрувальну криву. Для цього готують стандартні розчини хромату калію: 1мМ; 0,8мМ; 0,6мМ; 0,4мМ; 0,2мМ; 0,1мМ; 0,05мМ; 0,01мМ. Проводять реакцію, додаючи до розчину фенілкарбазиду по 0,05мл стандартних розчинів із врахуванням розведення. Результати дослідів наведено у табл. Таблиця Ефективність утилізації Cr(VI) мутантом S. sioyaensis № 138 за 14 діб інкубації Вихідна концентрація Cr(VI) у середовищі, мМ 5 10 50 10 15 20 Залишок Cr(VI) у середовищі після 14 діб 0,1 4,7 36,0 Відсоток перетвореного Cr(VI), % 98 53 28 Виявляють, що отриманий хром-резистентний мутант №138 здатний за 14 діб інкубації повністю відновити 4,9мМ Cr(VI) - 98 % відновлення. Також, після інкубації цього мутанта протягом 14 діб у середовищі, яке містить 10мМ Cr(VI) кількість залишкового Cr(VI) становить 4,7мМ: це 53 % відновлення. У середовищі з 50мМ Cr(VI) залишається 36мМ - 28 % відновлення (див. табл.). Виявлені відповідні рівні відновлення хрому перевищують відомі аналоги, описані у літературі [Mabrouk Mona Е. М. Statistical optimization of medium components for chromate reduction by halophilic Streptomyces sp. MS-2 / Mona E. M. Mabrouk // African Journal of Microb. Research-2008. - Vol.2. - P.103-109]. Застосування запропонованого способу біологічної утилізації шестивалентного хрому Cr(VI) з використанням отриманих штамів, які мають підвищену відновлювальну активність щодо Cr(VI), дає змогу отримати передбачуваний технічний результат, як підтверджено дослідженнями. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб біологічної утилізації шестивалентного хрому Cr(VI), що базується на використанні бактерійних клітин, який відрізняється тим, що як штам-очисник використовують Сr(VІ)-стійкий, прототрофний мутант штаму S. sioayensis Lv81, який вирощують протягом 240  336 годин у рідкому середовищі SG, яке додатково містить 5  50 мМ Cr(VI). Комп’ютерна верстка Н. Лисенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3