Трансформаційна суміш для трансформації cаcl2-компетентних клітин e.coli плазмідною днк

Реферат: Трансформаційна суміш для трансформації СаСl2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК містить компетентні клітини Е.соlі НВ101, в стерильному розчині 50 мМ СаСl2 + 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0 та ДНК плазміди pBR322. Додатково містить глюкозу, при наступному співвідношенні інгредієнтів на 94 мкл компетентних клітин Е.соlі НВ101 в стерильному розчині 50 мМ СаСl2 + 10 мМ Tris-HCl (Tris - (Hydroxymethyl) - Aminomethane), pH 8,0: ДНК плазміди pBR322-1,0 мкл; 40 % розчин глюкози - 1,0-5,0 мкл; стерильний розчин 50 мМ СаСl2 + 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0 - до об'єму 100 мкл. UA 71834 U (12) UA 71834 U UA 71834 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пропонована корисна модель належить до мікробіології, генної інженерії, молекулярної біології та біотехнології, а більш конкретно до трансформаційної суміші для трансформації СаСl2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК. Відома трансформаційна суміш для трансформації СаСl2-компетентних клітин Е. соlі плазмідною ДНК, що включає компетентні клітини Е. соlі НВ101 в стерильному розчині 50 мМ СаСІ2 (хлористого кальцію) + 10 мМ Tris (Tris - (Hydroxymethyl) - Aminomethane) - HCl, pH 8,0 та ДНК плазміди pBR322 /Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. / Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. - М.: Мир, 1984. - С. 239-2427. Недолік описаної суміші полягає у недостатньому виході трансформантів. Найбільш близькою до пропонованої корисної моделі за сукупністю суттєвих ознак є трансформаційна суміш для трансформації СаСl2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК, що включає компетентні клітини Е.соlі НВ101, в стерильному розчині 50 мМ СаСl2+10 мМ TrisHCI, pH 8,0 та ДНК плазміди pBR322, нівалін (галантаміну гідробромід) при наступному співвідношенні інгредієнтів на 100 мкл розчину: компетентних клітин Е.соlі НВ101 в стерильному розчині 50 мМ СаСl2 (хлористого кальцію) + 10 мМ Tris-HCl (Tris - (Hydroxymethyl) - Aminomethane), pH 8,0-94; ДНК плазміди pBR322-1,0; нівалін (галантаміну гідробромід) - 1,0-5,0; стерильний розчин 50 мМ СаСl2+10 мМ Tris-HCI, pH 8,0 - до 100 (заявка на видачу патенту України на корисну модель № u201108889, подана до Укрпатенту 15.07.2011 р., за якою 09.12.2011 р. прийнято рішення про видачу патенту на корисну модель). Недолік згаданої суміші полягає у тому, що нівалін є дорогим та малодоступним препаратом. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такої трансформаційної суміші для трансформації СаСl2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК, яка б дозволила суттєво підвищити вихід трансформантів. Пропонована, як і відома, трансформаційна суміш для трансформації СаСl 2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК, включає компетентні клітини Е.соlі НВ101 в стерильному розчині 50 мМ СаСl2+10 мМ Tris - НСl, рН 8,0 та ДНК плазміди pBR322, а, відповідно до пропозиції, додатково містить глюкозу, при наступному співвідношенні інгредієнтів: на 94 мкл компетентних клітин Е.соlі НВ101 в стерильному розчині 50 мМ СаСl2+10 мМ TrisHCl, рН 8,0: ДНК плазміди pBR322-1,0 мкл; 40 % розчин глюкози - 1,0-5,0 мкл; стерильний розчин 50 мМ СаСl2+10 мМ Tris-HCl, рН 8,0 - до об'єму 100 мкл. Згадана задача вирішується за рахунок створення умов для підвищення виживання компетентних клітин Е.соlі, трансформованих плазмідною ДНК, шляхом введення до складу суміші оптимальної кількості 40 % розчину глюкози. Глюкоза (С6Н12О6) - важливий моносахарид; білі кристали солодкі на смак, легко розчиняються у воді. Використовується як засіб посиленого харчування, або як лікарська речовина, при обробці тканини. Природна кристалічна глюкоза (виноградний цукор) представляє собою циклічну альфаформу. При розчиненні в воді вона переходить в ланцюгову, а через неї в бета-форму; при цьому установлюється динамічна рівновага між усіма формами. Бета-форма також може бути виділена в кристалічному вигляді; у водному розчині вона утворює рівноважну систему з іншими формами. Ланцюгова форма існує лише в розчинах, причому в дуже невеликій кількості, а в вільному вигляді не виділена. В бактеріальних системах глюкоза використовується як джерело енергії. Авторами експериментально встановлений той факт, що додавання розчину глюкози до трансформаційної суміші сприяє підвищенню ефективності трансформації (Таблиця). Ефективним виявилося додавання 1 (кінцева концентрація 0,4 %) та 5 (кінцева концентрація 2,0 %) мкл 40 % розчину глюкози до 94 мкл трансформаційної суміші з доведенням останньої до остаточного об'єму 100 мкл за допомогою стерильного розчину 50 мМ СаСl 2+10 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Більш ефективним виявилось додавання 5мкл (2 %) глюкози. Збільшення кількості глюкози більше ніж до 5 мкл (2 %) не використовується, оскільки воно призводить до пригнічення життєздатності бактеріальних клітин [Дж. Миллер Эксперименты в молекулярной генетике// М.: "Мир".-1976.-436 с.]. Присутність глюкози в трансформаційній суміші для трансформації СаСl 2-компетентних клітин Е.соlі плазмідною ДНК приводить до більш високого виходу трансформантів. 1 UA 71834 U 5 10 15 20 У пропонованому способі використовували 40 % розчин глюкози виробництва фірми "Фармак" (Росія). Пропонована корисна модель ілюструється наступними прикладами. Трансформація клітин Е.соlі НВ101 ДНК плазміди pBR322. Приклад І. Компетентні клітини Е.соlі НВ101 отримували так: Стерильний розчин 50 мМ СаСl2+10 мМ Tris-HCl, pH 8,0 залишали на 10 годин при 0 °C (льодяна баня). Наступної доби готували трансформаційну суміш: до 94 мкл компетентних клітин + 1,0 мкл (0,1 мкг) ДНК, додавали розчин глюкози в кількості 1мкл (що дорівнює 1 % об/об) (див. Таблицю 1) та стерильний розчин 50 мМ СаСl2+10 мМ Tris-HCl, pH 8,0 до кінцевого об'єму 100 мкл, витримували 30 хв. в льодяній бані, піддавали суміш температурному шоку (нагрівання до +42 °C на протязі 1,5 хв.), витримували ще 10 хв. в льодяній бані, додавали 4 об'єми рідкого живильного середовища, витримували 1 год. при +37 °C і висівали на селективне тверде живильне середовище з додаванням відповідних антибіотиків, а саме, ампіциліну та тетрацикліну й отримували вихід трансформантів в середньому 592±160 %. Приклад II. Компетентні клітини Е.соlі НВ101 отримували як у прикладі І, але коли наступної доби готували трансформаційну суміш: 94 мкл компетентних клітин + 1,0 мкл (0,1 мкг) ДНК, додавали розчин глюкози в кількості 5 мкл (що дорівнює 5 % об/об) (див. Таблицю), витримували 30 хв. в льодяній бані, піддавали суміш температурному шоку (+42 °C протягом 1,5 хв.), витримували ще 10 хв. в льодяній бані, додавали 4 об'єми рідкого живильного середовища, витримували 1 год. при 37 °C і висівали на селективне тверде живильне середовище з додаванням відповідних антибіотиків, а саме, ампіциліну та тетрацикліну, та отримували вихід трансформантів в середньому 1606±422 %. 25 Таблиця Вплив і різних концентрацій глюкози на вихід трансформантів № прикладу І II Концентрація Вихід трансформантів у досліді № досліду глюкози % (об/об) порівняно з контролем, % 1 696 1,0 2 278 3 802 1 1384 5,0 2 1013 3 2422 Середнє 592±160* 1606±422* Примітка: * - Р