Штам aerococcus viridans 167к, що виявляє протимікробну активність та лікарський засіб на його основі “віабак”

Винахід відноситься до медицини та біотехнології, зокрема до нових штамів мікроорганізмів-пробіотиків та медичних препаратів на їх основі. Бактеріотерапія та бактеріопрофілактика інфекцій різноманітної етіології і локалізації, а також патологічних процесів неінфекційного походження, набувають все більшу актуальність в зв'язку із зростанням розуміння ролі нормальної мікрофлори для організму людини в процесах неспецифічної резистентності до інфекцій, в формуванні імунних відповідей, антагоністичної ролі мікрофлори, участі в регуляції метаболічних процесів, а також у зв'язку з виявленням їх антидотії, антиоксидантної, антиканцерогенної ролі в макроорганізмі. На сьогодні існує велика кількість біопрепаратів для внутрішнього застосування, що як активний агент містять відомі штами мікроорганізмів, наприклад, такі як біфідум-, лакто- та колібактерин. Основним фактором ефективності біфідумбактерину є антагоністична активність, зумовлена сильним кислотоутворенням, продукуванням лізоциму. Ме ханізм дії лактобактерину близький до біфідумбактерину і також зумовлюється сильним кислотоутворенням. Цей препарат найбільш дієвий при лікуванні гострих та хронічних кишкових інфекцій, корекції дисбактеріозів. Поскільки названі препарати містять штами-представники виключно індигенної мікрофлори кишечнику, які здійснюють свою антагоністичну дію та антагоністичну здатність колонізації тільки для слизових оболонок кишечнику, область їх застосування вузька і обмежується лікуванням і профілактичним впливом при інфекціях кишечнику. В основу групи винаходів, що заявляється, поставлено задачу розширити асортимент біологічних препаратів, що містять ліофілізовані життєздатні клітини бактерій та носій і відрізняються більш широким спектром дії. Зазначену задачу вирішує штам Aerococcus viridans №167К (реєстраційний номер в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України - Aerococcus viridans ІMB В-7069, скорочено - р.н. ІMB В-7069) для виготовлення лікарських препаратів, косметичних засобів та біологічно активних добавок. Найбільш близьким штамом до запропонованого є штам Aerococcus viridans №167 (per. номер ІMB В7041). виділений з грудного молока. Однак використання цього штаму не завжди ефективне через недостатню технологічність та помірну біологічну активність. В основу винаходу поставлена задача одержати більш продуктивний штам Aerococcus viridans (шляхом використання методів аналітичної селекції) з високими адгезивними властивостями та широким спектром антагоністичної дії. Поставлена задача вирішена шляхом одержання нового штаму Aerococcus viridans № 167K, який виділений методами аналітичної селекції із штаму Aerococcus viridans №167 (р.н. ІMB В-7041) і задепонований у колекції Інституту мікробіології та вірусології (ІMB) НАН України під номером ІMB В-7069. Штам ідентифікований по «Краткому определителю бактерий» Бергі. У результаті селекційної роботи вищезгаданий штам набуває таких культурально-морфологічних та фізіолого-біохімічних властивостей, які й забезпечують його високу продуктивність при лікуванні та профілактиці захворювань слизових оболонок та шкірних покривів. Культурально-морфологічні властивості штаму. Грампопозитивні коки, нерухомі, 1-2мкм у діаметрі, що розташовуються парами, чи нерегулярними скупченнями. Клітинна стінка складається з двох електронощільних і одного менш щільного проміжного шару. Товщина цитоплазматичної мембрани 200-400А. Цитоплазма клітин має гетерогенний характер. Вона заповнена дрібними гранулами, полірибосомами, сконцентрованими навколо мезосом чи ядерних утворень. Колонії аерококів на щільному живильному агарі круглі, 0,5-1,0мм у діаметрі, напівпрозорі, білі чи сірі, іноді бусинкоподібні. На кров'яному агарі колонії аерококів мають великі розміри, оточені зоною позеленіння, можливо, у результаті дії лактат-оксидази. Ріст у живильному бульйоні супроводжується гомогенним помутнінням, що має тенденцію перетворюватися в зернистий осад. Ріст аерококів залежить від наявності в середовищі біотину, пантотенової і нікотинової кислот. Штам не потребує для свого росту ві тамінів групи "В": тіаміну, рибофлавіну, пиридоксину, фолієвої і флавонової кислот. Tween-80 заміняє потребу в біотині. Для росту аерококів необхідні екзогенні пурини. Гуанін і ксантин взаємозамінні з аденіном. Штам не має потреби в екзогенних пиримідинах. Потреба в амінокислотах варіабельна. Потреба для росту в біотині, нікотиновій, пантотеновій кислотах, пуринах і незалежність від наявності в середовищі вітамінів групи "В", відрізняє аерококки від інших грампозитивних коків, наприклад, педиококів, що потребують фолієвої кислоти, чи стрептококів - потреба у тіаміні. Біохімічна активність. При культивуванні на молоці з 1,0% метиленовим синім не відновлюють останній, підкисляють молоко при відсутності згортання, желатину не розріджують, аргінін, крохмаль, ескулін не гідролізують. Аерококи продукують кислоту, але не газ, при культивуванні на середовищах із глюкозою, мальтозою, лактозою, манітолом, сахарозою. Ацетоїн не утворюють, рафінозу не зброджують, каталазу не продукують, коагулазу не утворюють. При культивуванні в глюкозному (1%) бульйоні - кінцеве рН 5,1-5,8 та ріст мікроаерофільний. При аеробному рості продукують пероксид водню. Каталазна активність аерококів може мати негеміновий характер. Аерококи містять фермент, що захищає їх від супероксидних радикалів - супероксидну дисмутазу, кофактором якої є марганець. За киснестійкістю аерококи займають друге місце після S.faecalis і знаходяться перед Е.соїі. Максимальна продукція перекису водню культурами аерококів відзначається в ранній період логарифмічної фази культури. У аерококів - сильних продуцентів пероксиду водню стаціонарна фаза розвитку культури нетривала. Відзначається їхня висока чутливість до антибіотиків. Хімічний склад. Клітинна стінка аерококків містить глюкозу, галактозу, галактозамін і не містить рамнозу, гліцерол чи рибітол. Визначено однаковий вміст Г+Ц пар у ДНК аерококів і педиококів, рівний 41-43%. Вміст Г+Ц пар у ДНК аерококів коливався в межах 39,5-42,0%. В аерококів, виділених із грудного молока, вміст Г+Ц пар - 39,942,0%, з коров'ячого - 39,5-41,6%. Біологічні властивості Антагоністичну активність штаму Aerococcus viridans 167K (р.н. ІMB В-7069) перевіряють по відношенню 9 тест-штамів - Staphylococcus aureus 209р, Proteus vulgaris 401, Proteus mirabilis Η2091, Klebsiella pneumoniae 320, Pseudomonas aeraginosa 1312, Shigella sonnei, Shigella flexneri 1046, Salmonella typhimurium 5710, Vibrio Nag р.6078 - методом штриха на щільному поживному середовищі у ча шках Петрі. Ампулу з культурою розводять 0,9% розчином натрію хлориду, з розрахунку вмісту 2-10 аерококів у 1мл і засівають штрихом по діаметру чашки з ΜΠΑ, що містить 1% глюкози і 0,4 мг/мл калію йодиду. Після інкубації посівів у термостаті при температурі (36±1)°С протягом 48 годин перпендикулярно вирослій культурі аерококів підсівають петлею Генле культур у тест-штамів. Після 24-х годин інкубації при температурі (36±1)°С зони затримки росту тест-к ультури вимірюють від краю штриха до початку росту тест-культури. Зони пригнічення росту тест-штамів повинні бути не менше ніж 7мм для Pseudomonas aeraginosa 1312 і не менше ніж 15мм для всіх інших к ультур, у порівнянні з 5мм та 10мм прототипу. Оксидазна активність. З антагоністичною активністю штама корелює показник оксидазної активності, який визначають по здатності аерококів змінювати забарвлення крохмалю в складі поживного середовища з йодидом калію. Діаметр посиніння крохмалю навколо штриха Aerococcus viridans 167К (р.н. ІMB В-7069) складає не менше 30мм. Здатність до адгезії in vitro вивчали на переживаючій культурі епітеліоцитів кишечника кроликів та білих безпородних мишей за загальноприйнятою методикою. Після годинної інкубації при 37°С культури епітеліоцитів разом з аерококами штамів Aerococcus viridans 167K (р.н. ІМВ В-7069) та Aerococcus viridans 167 (р.н. ІMB В-7041) готували препарати для електронної мікроскопії. Ступінь адгезії оцінювали за мазками, забарвленими 1% розчином тулоїдинового синього. При цьому визначали кількість клітин, що знаходяться в стані контакту з аерококами, та інтактних. Результати наведені в таблиці. Таблиця 1 Адсорбційна здатність штамів Aerococcus viridans 167K (р.н. ІMB В-7069) та Aerococcus viridans 167 (р.н. ІMB В-7041) до ентероцитів кроликів та білих мишей Ентероцити Показник адгезії (%) Штам аерококів A. viridans В-7069) A. viridans В-7041) A. viridans В-7069) A. viridans В-7041) 167K (р.н. ІMB 167 (р.н. ІMB 167K (р.н. ІMB 167 (р.н. ІMB кролика 80 кролика 64,5 білої миші 82,5 білої миші 75 Згідно з наведеними даними обидва штами аерококів однаково активно адсорбувались на ентероцитах як кролика, так і миші, але заявлений штам демонстрував більш високу е фективність у порівнянні з прототипом. Вплив на фагоцитарну активність поліморфноядерних нейтрофілів периферичної крові. Продуктами метаболізму A. viridans 167K (р.н. ІМВ В-7069) є речовини, необхідні в процесі здійснення фагоцитарної функції - перекис водню, супероксиддисмутаза, лізоцимоподібні речовини, токсичні форми кисню, а також гідроксильні радикали. Активність нейтрофільних гранулоцитів оцінювали за фагоцитарною активністю та індексом завершеності фагоцитозу - кілінгом, що найбільш повно характеризує функціональну здатність нейтрофільних фагоцитів за рахунок утворення гранулоцитами токсичних форм кисню, а також гідроксильного радикалу. Супероксиддисмутаза зв'язує цей кисень з воднем, утворюючи перекис водню. Процеси перекісного окислення ведуть до пошкодження мембран мікроорганізмів, зумовлюючи їх загибель. Проведено дві серії дослідів in vitro з метою вияснити вплив ферментного комплексу A. viridans 167К (р.н. ІМВ В-7069) на фагоцитарну функцію поліморфноядерних нейтрофілів. Результати подані в таблицях. Таблиця 2 Вплив ферментного комплексу A. viridans 167K (р.н. ІМВ В-7069) в дозі 0,01мл на фагоцитарну активність поліморфноядерних нейтрофілів в експерименті in vitro (M±m) Умови досліду (п=3) 1. контроль дослід Експозиція 30 хвилин ФА% ФЧ ФІ 61 5,50 3,36 66 6,15 4,06 ФА% 65 60 Експозиція 2 години ФЧ ФІ 7,55 4,90 3,78 2,27 ІЗФ 0,73 1,63* 2. контроль 45 4,11 1,85 дослід 49 4.00 1,96 3. контроль 70 6,13 4,30 дослід 77 6,48 4,99 4. контроль 79 5,70 4,50 дослід 70 3,87 2,70 5. контроль 59 4,5 3,40 дослід 63 5,2 3,67 Примітка: *р