Спосіб культивування калусної тканини буркуну лікарського (melilotus officinalis pall.)

Реферат: Спосіб культивування калусної тканини буркуну лікарського (Melilotus officinalis Pall.) включає виділення експланту, стерилізацію, культивування його на живильному середовищі, знімання біомаси, збереження частини її для подальшого культивування. Експланти використовують насіння буркуну лікарського (Melilotus officinalis Pall.), культивування здійснюють на середовищі Мурасіге і Скуга, що містить половинну концентрацію макро- і мікроелементів. UA 72864 U (12) UA 72864 U UA 72864 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, а саме до способу культивування калусної тканини буркуну лікарського, що є цінною сировиною для отримання біологічно активних речовин (БАР), і може бути використано у фармацевтичній, харчовій і косметичній промисловості. У біотехнології відомі способи отримання біомаси калусних тканин деяких лікарських рослин - продуцентів БАР: женьшеня, солодки голої, плюща, ломиноса виноградолистого, астрагала шерстистоквіткового та ін. Відомі способи культивування калусної тканини женьшеня шляхом посадки інокулюма на агаризоване живильне середовище Мурасіге і Скуга, культивування в стандартних умовах і відбору частини біомаси, що виросла, для культивування на модифікованому живильному середовищі, з якого потім одержують біологічно активні речовини, а частину біомаси, що залишилася, використовують для подальшого вирощування інокулятного матеріалу (А.с. СРСР №1036053, Кл. С 12 N 5/00, 1982). Найбільш близьким аналогом за технічною суттю є спосіб культивування калусної тканини плюща (Hedera helix L.), що включає виділення експланту (зародки насіння), стерилізацію і культивування його на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому для ініціації калусоутворення фітогормонами 2,4-Д і 6-БАП, протягом 20-30 діб в темряві, знімання біомаси і збереження частини її для подальшого культивування (Деклараційний патент на корисну 5 модель № 5519, МПК С 12 N 5/04. Спосіб культивування калусної тканини плюща Hedera helix L / І.М. Юркова, О.М. Бугара, Л.М. Теплицька, Д.О. Скляренко. - Заявл. 29.06.2004. - Опубл. 15.03.2005, Бюл. № 3). В основу корисної моделі поставлена задача створення способу культивування калусної тканини буркуну лікарського. Для вирішення поставленої задачі в запропонованому способі культивування калусної тканини буркуну лікарського (Melilotus officinalis Pall.), що включає попереднє виділення експланту, стерилізацію його відомими методами, культивування на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, модифікованому фітогормонами, знімання біомаси і збереження частини її для подальшого культивування, відповідно до корисної моделі як експланти використовують насіння буркуну лікарського, стерилізацію проводять відомими методами, а культивування здійснюють на середовищі Мурасіге і Скуга, що містить половинну концентрацію макро- і мікроелементів, сахарозу - 30 г/л, 6-бензиламінопурин - 0,2-0,5 мг/л і 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту - 1,0-2,0 мг/л протягом 20-30 діб. Буркун лікарський містить глікозид мелілотозид, мелілотин, дикумарол, кумарин, похідні пурину, жироподібні речовини, кумарова, мелілотова, фенолкарбонові кислоти, білок, ефірне масло, містить достатню кількість калію, молібдену. Буркун лікарський належить до рослин, що накопичують селен. У його траві знайдено до 1,9 мг/кг органічного селену, який повністю засвоюється організмом. Біологічно активні речовини буркуну лікарського забезпечують широкий спектр фармакологічних ефектів. Кумарин здатний піднімати рівень лейкоцитів в крові, збільшувати хвилинний об'єм серця, підвищувати артеріальний тиск (систола), покращувати периферичний і мозковий кровообіг. Основна сфера застосування в медицині буркуну це варикозне розширення вен і геморой. Створено безліч галенових препаратів, а так само мазей з активною речовиною буркуну. У народній медицині трава буркуну лікарського застосовується як послаблюючий засіб, входить до складу пом'якшувальних зборів. Настоями і відварами лікують гінекологічні захворювання, метеоризм, захворювання легень і верхніх дихальних доріг, атеросклероз і гіпертонію, а так само використовують як болезаспокійливе, седативне, відхаркувальне, діуретичне, гіпотензивне, антибактеріальне, антиспазматичне. Буркун лікарський застосовується в медицині багатьох країн світу. У Німеччині їм лікують порушення при хронічній венозній недостатності, тромбофлебіт, посттромботичний синдром, геморой і лімфостаз, а так само удари і поверхневі крововиливи. У аюрведичній медицині буркун застосовують як засіб, що має гемостатичну, пом'якшувальну і полегшуючу метеоризм дію. У китайській традиційній медицині буркун присутній в трав'яних зборах для лікування епідемічного енцефаліту. У Болгарії настій і відвар буркуну використовують як антикоагулянт і фібринолітичний засіб. У Польщі буркуном лікують безсоння, неврастенії, сердечні і головні болі. У Австрії хвороби шлунку і бронхіти. Використання замість інтактних рослин буркуну їх клітинних культур, одержаних біотехнологічним методом, має ряд переваг: зменшення антропогенної дії на дику природу, можливість отримання фітомаси, повністю вільної від полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.) і управління процесом біосинтезу цільових продуктів. 60 1 UA 72864 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 1 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить: половинну концентрацію макроі мікроелементів, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant.-1962. - Bd. 15. - № 13. - P.473-497), мг/л: агар - 6000, тіамін - 1,0, піродоксин - 0,5, нікотинова кислота 0,8, аскорбінова кислота 0,8-1,2, 6-бензиламінопурин - 0,2 і 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 1,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя буркуну лікарського), заздалегідь стерилізовані 70 %-ним розчином етилового спирту протягом 1 хвилини, культивують при температурі 18 °C протягом 25 діб, після чого калус витягують з посудини, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 250 мг. Приклад 2 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить: половинну концентрацію макроі мікроелементів, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant.-1962. - Bd. 15. - № 13. - P.473-497), мг/л: агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, 6-бензиламінопурин - 0,2 і 2,4дихлорфеноксіоцтова кислота - 1,5, розливають в культиваційні посудини, ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя буркуну лікарського), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °C протягом 30 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланта і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 235 мг. Приклад 3 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить: половинну концентрацію макроі мікроелементів, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant.-1962. - Bd. 15. - № 13. - P.473-497), мг/л: агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, 6-бензиламінопурин - 0,5 і 2,4дихлорфеноксиоцтова кислота - 2,0, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя буркуну лікарського), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 18 °C протягом 25 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланта і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 260 мг. Приклад 4 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить: половинну концентрацію макроі мікроелементів, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant.-1962. - Bd. 15. - № 13. - P.473-497), мг/л: агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, 6-бензіламинопурин - 0,1 і 2,4дихлорфеноксиоцтова кислота - 0,7, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя буркуну лікарського), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофену 10 Н протягом 10 хвилин, культивують в темноті при температурі 20 °C протягом 25 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланта і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 120 мг. Приклад 5 Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить: половинну концентрацію макроі мікроелементів, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant.-1962. - Bd. 15. - № 13. - P.473-497), мг/л: агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, 6-бензіламінопурин - 0,7 і 2,4дихлорфеноксиоцтова кислота - 2,5, розливають в культиваційні посудини ємкістю 50 мл кожна. Закупорені ватно-марлевими пробками посудини стерилізують в автоклаві при 118 °C протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя буркуну лікарського), заздалегідь простерилізовані 50 %-ним розчином брадофена 10Н протягом 10 хвилин, культивують в 2 UA 72864 U 5 10 15 темноті при температурі 20 °C протягом 25 діб, після чого калус витягують з посудин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 165 мг. Пропонований спосіб культивування калусної тканини буркуну лікарського може бути використаний для біотехнологічного виробництва його біомаси з метою отримання біологічно активних речовин - тритерпенових глікозидів і органічного селену, що є основою для цінних лікарських препаратів. Перевагою даного способу є зниження антропогенної дії на навколишнє середовище і отримання екологічно чистої сировини не залежно від періоду вегетації. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб культивування калусної тканини буркуну лікарського (Melilotus officinalis Pall.), який включає виділення експланту, стерилізацію і культивування його на живильному середовищі, що містить мінеральні солі, мікроелементи, інозит, тіамін, піродоксин, нікотинову кислоту, аскорбінову кислоту, сахарозу, агар і фітогормони, знімання біомаси, збереження частини її для подальшого культивування, який відрізняється тим, що як експланти використовують насіння буркуну лікарського (Melilotus officinalis Pall.), а культивування здійснюють на середовищі Мурасіге і Скуга, що містить половинну концентрацію макро- і мікроелементів, 6бензиламінопурин - 0,2-0,5 мг/л і 2,4-дихлорфеноксіоцтову кислоту - 1,0-2,0 мг/л. 20 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3