Спосіб культивування калусної тканини астрагалу шерстистоквіткового (astragalus dasyanthus pall.), яка збагачена селеном

Спосіб культивування калусної тканини астрагалу шерстистоквіткового (Astragalus dasyanthus Pall.), збагаченої селеном, що включає виділення експланта (сегменти листової пластинки), стерилізацію і культивування його на живильному середовищі, що містить мінеральні солі, мікроелемен 3 Завданням корисної моделі є збагачення біомаси калусної тканини астрагалу селеном. Для вирішення поставленого завдання в запропонованому способі культивування калусної тканини астрагалу, що включає попереднє виділення експланту, стерилізацію його відомими методами, культивування на живильному середовищі, що містить фітогормони, знімання біомаси і збереження частини її для подальшого культивування, відповідно до винаходу культивування здійснюють на живильному середовищі Гамборга и Евелега, що містить, фітогормони, мг/л: 2,4дихлорфеноксіоцетову кислоту - 1,5-2,5; 6бензиламінопурин - 0,2-0,5, селенистокислий натрій - 5,0-10,0 з розрахунку на селен або живильному середовищі Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: 2,4-дихлорфеноксіоцетову кислоту - 1,5-2,5; 6-бензиламінопурин - 0,2-0,5 мг/л, кінетин - 0,2-0,5, селенистокислий натрій - 5,0-15,0 з розрахунку на селен. На живильне середовище висаджують інокулят масою 2,0-2,5 г/50 мл. Культивують в стандартних умовах протягом 40-80 діб у темряві, в кінці циклу культивування біомасу перемішують, одну частину використовують для відтворення інокуляту, а іншу - для отримання цільового продукту. Астрагал шерстистоквітковий відноситься до природних концентраторів селену. У його траві знайдено до 1,5 мг% органічного селену, який повністю засвоюється організмом. Це приблизно в 5000 разів більше, ніж в часнику, петрушці, кропі, в 1250 разів - ніж у солодці, в 455 разів - ніж у лимонника китайського. Традиційний підхід для отримання лікарської рослинної сировини, що містить мікроелементи, оснований на інтродукції й вирощуванні рослин на ґрунтах, штучно збагачених відсутніми мікроелементами. Однак такий підхід вимагає додаткових земельних ресурсів, значних витрат на вирощування рослин, їхнє збирання й переробку, а також є недостатньо ефективним у зв'язку із втратами додатково внесених у грунт мікроелементів. Більш перспективний підхід може бути оснований на одержанні клітинних культур лікарських рослин, що концентрують певні мікроелементи. Використання замість інтактних рослин астрагала їх клітинних культур, одержаних біотехнологічним методом, має ряд переваг: зменшення антропогенної дії на дику природу (астрагал шерстистоквітковий занесений в «Червону книгу» і на території України в даний час зустрічається дуже рідко), можливість отримання фітомаси, повністю вільної від полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.) і управління процесом біосинтезу цільових продуктів. Приклад 1 (прототип). Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і Інозит за прописом Мурасіге і Скута (Murashige Т., Skoog F. // Phisiol. Plant. - 1962. Bd.15. - № 13. - P.473-497), агар - 6000, тіамін - 1,0, піродоксин - 0,5, нікотинова кислота - 0,8, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, кінетин - 0,2, 6бензиламінопурин -0,2 і 2,4-дихлорфеноксіоцетова кислота - 1,0, розливають в культиваційні судини 54431 4 ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватно-марлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 % - ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 18 °С протягом 20 діб, після чого калус витягують з судини, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 300 мг. Вміст селену - 0,08 мг/кг сухої речовини. Приклад 2. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, кінетин - 0,2, 6-бензиламінопурин - 0,2, 2,4дихлорфеноксіоцетова кислота - 1,0 і селеністокіслий натрій -5,0, розливають в культиваційні судини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 % ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 40 діб,після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 280 мг. Вміст селену - 334 мг/кг сухої речовини. Приклад 3. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, кінетин - 0,3, 6-бензиламінопурин - 0,5, 2,4дихлорфеноксіоцетова кислота - 2,0 і селеністокіслий натрій -10,0, розливають в культиваційні судини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С с протягом ЗО хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50%-ним розчином брадофена ІОН протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 60 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 250 мг. Вміст селену - 285 мг/кг сухої речовини. Приклад 4. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Мурасіге і Скуга, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,8-1,2, кінетин - 0,5, 6-бензиламінопурин - 0,3, 2,4 5 54431 дихлорфеноксіоцетова кислота ~ 3,0 і селеністокіслий натрій -15,0, розливають в культиваційні судини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50%-ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 80 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 230 мг. Вміст селену -176 мг/кг сухої речовини. Приклад 5. Готують живильне середовище Гамборга и Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга и Евелега, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,81,2, кінетин - 0,2, 6-бензиламінопурин - 0,2, 2,4дихлорфеноксіоцетова кислота - 1,0 і селеністокіслий натрій -5,0, розливають в культиваційні судини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50%-ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 40 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 265 мг. Вміст селену - 315 мг/кг сухої речовини. Приклад 6. Готують живильне середовище Гамборга и Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга и Евелега, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,81,2, кінетин - 0,3, 6-бензиламінопурин - 0,5, 2,4дихлорфеноксіоцетова кислота - 2,0 і селеністокіслий натрій -10,0, розливають в культиваційні су Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 дини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 ° С протягом ЗО хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50%-ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 60 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 245 мг. Вміст селену - 298 мг/кг сухої речовини. Приклад 7. Готують живильне середовище Гамборга и Евелега, що містить, мг/л: мінеральні солі, мікроелементи, сахарозу і інозит за прописом Гамборга и Евелега, агар - 6500, тіамін - 1,5, піродоксин - 0,75, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота - 0,81,2, кінетин - 0,5, 6-бензиламінопурин - 0,3, 2,4дихлорфеноксіоцетова кислота - 3,0 і селеністокіслий натрій -15,0, розливають в культиваційні судини, ємкістю 50 мл кожен. Закупорені ватномарлевими пробками судини стерилізують в автоклаві при 118 °С протягом 30 хвилин, рН середовища до автоклавування 5,5-5,8. У застигле живильне середовище в стерильних умовах вводять експланти (сегменти листя астрагала шерстистоквіткового), заздалегідь простерилізовані 50 % ним розчином брадофена 10 Н протягом 10 хвилин, культивують при температурі 20 °С протягом 80 діб, після чого калус витягують з судин, відокремлюють від експланту і зважують. Вихід сухої біомаси при п'ятикратній повторності досліду склав 240 мг. Вміст селену - 182 мг/кг сухої речовини. Пропонований спосіб культивування калусної тканини астрагала шерстистоквіткового, збагаченої селеном, може бути використаний для біотехнологічного виробництва його біомаси з метою отримання органічного селену, що є основою для цінних лікарських препаратів. Перевагою даного способу є зниження антропогенної дії на навколишнє середовище і отримання екологічно чистої сировини не залежно від періоду вегетації. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601