Спосіб виявлення та оцінка активності інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків

Реферат: Спосіб виявлення та оцінка активності інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків включає забарвлення в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі. Визначають інтенсивність забарвлення в еякуляті з візуальною його оцінкою за 10-бальною шкалою з порівнянням забарвлення дослідного зразка з калібрувальним стандартом, який оцінюють від слабо-синього - 1 бал, до темно-синього кольору - 10 балів, при цьому інтенсивність забарвлення еякуляту більше 1 бала уможливлює виявлення та оцінку активності інфекційного запалення по інтенсивності забарвлення еякуляту до 10 балів органів урогенітального тракту, малодоступних для дослідження локалізацій. UA 75530 U (54) СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ ТА ОЦІНКА АКТИВНОСТІ ІНФЕКЦІЙНОГО ЗАПАЛЕННЯ ОРГАНІВ УРОГЕНІТАЛЬНОГО ТРАКТУ У ЧОЛОВІКІВ UA 75530 U UA 75530 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до медицини, а саме до урології та клінічної імунології, і може бути використаний для виявлення та оцінки активності урогенітального запалення за показниками оксидативного стресу в еякуляті. Відомо, що підвищена кількість лейкоцитів в еякуляті корелює з бактеріоспермією та є основним показником інфекційного гострого та латентного запалення органів репродуктивної системи. Лейкоспермія супроводжується оксидативним стресом, який розвивається внаслідок "респіраторного вибуху" - різкого посилення кисневого метаболізму в активованих клітинах, результатом якого є утворення первинних (О2 супероксидний аніон, перекись водню Н2О2, 1 1 гідроксильний радикал ОН, синглетний кисень Δq і Σq+) та вторинних метаболітів (гіпохлорна кислота НОСl, гіпохлорид СlO", хлорамін, продукти перикисного окислення ліпідів) активних форм кисню за участю ферментів гексозомонофосфатного шунта, а саме НАДФН-оксидазної системи (NADPH-oxidase). Оксидативний: стрес є і однією з важливих характеристик еякуляту, в якому активні форми кисню продукують, крім сперматозоїдів, також і лейкоцити, а їх присутність в еякуляті значною мірою забезпечують простата та сім'яні пухирці. Визнано також, що необхідним дискримінантним показником оксидативного стресу в спермі є розрахунок співвідношення активної форми кисню до антиоксидантної активності. Відомо, що для оцінки оксидативного стресу в сім'яній плазмі є luminol-залежний хемілюмінесцентний метод [1], який включає визначення співвідношення активної форми кисню до антиоксидантної активності, тобто представлена повна характеристика неферментативної антиоксидантної активності та продукції активних форм кисню в сім'яній плазмі на luminometerприладі. Недоліком способу є те, що показник оксидативного стресу в сім'яній плазмі отримують хемілюмінесцентним методом на luminometer-приладі, що обмежує широке використання методу в клінічній практиці. Відомий також спосіб оцінки оксидативного стресу в лейкоцитах крові у хворих на хронічні захворювання легень за допомогою нітросинього тетразолію [2], який взятий за прототип, заснований на реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів діформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі в лейкоцитах крові. Недоліком способу є те, що спосіб використовують тільки для мікроскопічної оцінки оксидативного стресу в лейкоцитах крові. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб виявлення та оцінка активності інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків, шляхом визначення інтенсивності забарвлення еякуляту в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолія до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі в еякуляті хворих на хронічний простатит з візуальною оцінкою за 10-бальною шкалою та порівнянням забарвлення дослідного зразка з калібрувальним стандартом, якій оцінюють від слабо-синього - 1 бал до темно-синього кольору - 10 балів, при цьому інтенсивність забарвлення еякуляту більше 1 бала, як в нормі, уможливлює виявлення та оцінку активності інфекційного запалення по інтенсивності забарвлення еякуляту до 10 балів органів урогенітального тракту, малодоступних для дослідження локалізацій, що дає можливість виявити інфекційне запалення органів урогенітального тракту, навіть при відсутності лейкоспермії, чи у разі виникнення труднощів мікроскопічної ідентифікації лейкоцитів в еякуляті. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб виявлення та оцінка активності інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків, що включає забарвлення в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі, згідно з корисною моделлю, визначають інтенсивність забарвлення в еякуляті з візуальною його оцінкою за 10бальною шкалою з порівнянням забарвлення дослідного зразка з калібрувальним стандартом, який оцінюють від слабо-синього - 1 бал, до темно-синього кольору - 10 балів, при цьому інтенсивність забарвлення еякуляту більше 1 бала уможливлює виявлення та оцінку активності інфекційного запалення по інтенсивності забарвлення еякуляту до 10 балів органів урогенітального тракту, малодоступних для дослідження локалізацій. Спосіб виявлення та оцінка інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків виконують наступним чином: в скляну центрифужну пробірку напівавтоматичною піпеткою з наконечником разового використання додають 100 мікролітрів еякуляту та 100 мікролітрів 0,1 % розчину нітросинього тетразолію у фосфатному буфері (рН 7,2-7,4), проби ретельно розмішують та витримують 30 хвилин в термостаті при t 37 °C. 1 UA 75530 U 5 Інтенсивність забарвлення еякуляту депозитами диформазану оцінюють візуально за 10бальною шкалою порівнянням забарвлення дослідного зразка з калібрувальним стандартом (від слабо-синього - 1 бал до темно-синього кольору 10 балів), який виготовляють перед застосуванням методу, розведенням у розріджувачі (фосфатний буфер рН 7,2-7,4) трьох зразків 6 еякулятів (робочі зразки) хворих із значною лейкоспермією (більшою за 5·10 од/мл), де інтенсивність забарвлення депозитами диформазану максимально виражена, схема розведення робочих зразків та оцінка розведення в балах наведена в таблиці 1. Таблиця 1 Схема розведення робочих зразків еякуляту та оцінка інтенсивності забарвлення депозитами диформазану в балах Об'єм робочого зразку 10 мікролітрів 20 мікролітрів 30 мікролітрів 40 мікролітрів 50 мікролітрів 60 мікролітрів 70 мікролітрів 80 мікролітрів 90 мікролітрів 100 мікролітрів 10 15 Розріджувач (фосфатний буфер рН 7,2-7,4) 90 мікролітрів 80 мікролітрів 70 мікролітрів 60 мікролітрів 50 мікролітрів 40 мікролітрів 30 мікролітрів 20 мікролітрів 10 мікролітрів Не вноситься Кількість балів 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Практичне використання способу, що пропонується, проведено в лабораторії імунології та відділі сексопатології та андрології ДУ "Інститут урології НАМН України". Визначення показників оксидативного стресу в еякуляті проведено у 180 хворих на хронічний простатит, віком 18-45 років. В залежності від кількості лейкоцитів в еякуляті пацієнти поділені на дві групи: 1 група включає 100 чоловіків хворих на хронічний простатит з лейкоспермією (кількість лейкоцитів 6 більше 1×10 /мл еякуляту), 2 група - 80 чоловіків - з кількістю лейкоцитів в 1 мл еякуляту була 6 менше чи дорівнює 1×10 /мл еякуляту. Контрольну групу складають 20 здорових чоловіків, дані наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Зв'язок між кількістю лейкоцитів в еякуляті та інтенсивністю забарвлення еякуляту депозитами (за даними описової статистики) Інтенсивність Групи забарвлення (в досліджуваних медіана балах) 1 (n=100) 7,0±1,0 6 2 (n=80) 3,0±1,0 0,8 Контрольна 1,0 1,0 (n=20) 20 25 30 Кількість лейкоцитів r похибка 25 75 квартиль медіани квартиль 0,7873 4 9 0,364 0,2658 0,3 1,0 0 0,782 p 0,05 0,05). При цьому у частини пацієнтів інтенсивність забарвлення еякуляту депозитами диформазану була значно збільшеною. У здорових чоловіків показник тесту на нітросиній тетразолій в еякуляті не перевищує одиниці. Наводимо приклади застосування запропонованого способу. Приклад 1. Хв. С, тем. карта № 475/1. Діагноз: підгострий хронічний простатит, екскреторнотоксичне непліддя, поставлений хворому на підставі клініко-лабораторного обстеження. За 6 даними спермограми кількість лейкоцитів в еякуляті складає 3×10 /мл. За результатами тесту на нітросиній тетразолій інтенсивність забарвлення еякуляту депозитами диформазану за запропонованим способом складає 6 балів за 10-ти бальною шкалою. Тобто, у хворого показник 2 UA 75530 U 5 10 15 20 25 30 35 лейкоспермії знаходиться в прямій відповідності до показників тесту на нітросиній тетразолій, що підтверджує наявність інфекційного запалення. Приклад 2. Хв. Г., тем. карта № 448/11. Діагноз хронічний простатит, екскреторно-токсичне 6 непліддя. За даними спермограми кількість лейкоцитів в еякуляті складає 1×10 /мл. За результатами тесту на нітросиній тетразолій інтенсивність забарвлення еякуляту депозитами диформазану за запропонованим способом складає 8 балів за 10-ти бальною шкалою. Тобто, у хворого показник лейкоспермії не знаходиться в прямій відповідності до показника тесту на нітросиній тетразолій, що потребує більш прискіпливої уваги до результатів сперматологічного дослідження. Подальший аналіз виявив, що був порушений алгоритм забору біологічного матеріалу: в той же день перед одержанням еякуляту хворому було проведено забір секрету передміхурової залози. Обстеження хворого через 10 діб виявило, що кількість лейкоцитів в 6 еякуляті становить 3×10 /мл, тобто у хворого існує інфекційне запалення. Приклад 3. Хв. С., тем. карта № 77/12. Діагноз хронічний простатит, екскреторно-токсичне непліддя, поставлений хворому на підставі клініко-лабораторного обстеження. Значне збільшення в'язкості еякуляту, наявність детриту та тяжів густого слизу складали труднощі для визначення кількості лейкоцитів в еякуляті; візуально в нативному препараті їх кількість оцінено 5-8 од. у полі зору. За рекомендаціями ВООЗ, у разі виникнення труднощів при морфологічній ідентифікації лейкоцитів, діагностувати їх в еякуляті слід за допомогою додаткового методу фарбування препарату на пероксидазу з використанням ортотолуїдину. За результатами тесту на нітросиній тетразолій інтенсивність забарвлення еякуляту депозитами диформазану за запропонованим способом складає 8 балів за 10-ти бальною шкалою. З урахуванням даних, що показник лейкоспермії знаходиться в прямій відповідності до показників тесту на нітросиній тетразолій, у хворого значно збільшена кількість лейкоцитів в еякуляті. Тобто за показниками оксидативного стресу в тесті на нітросиній тетразолій запропонований спосіб дає можливість виявити та оцінити активність урогенітального запалення. Таким чином, спосіб виявлення та оцінка інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків простий у виконанні і дає можливість виявити та оцінити по інтенсивності забарвлення еякуляту активність інфекційного запалення органів урогенітального тракту, малодоступних для дослідження локалізацій, навіть у разі відсутності лейкоспермії чи виникненні труднощів мікроскопічної ідентифікації лейкоцитів в еякуляті. Джерела інформації: 1. Esfandiari N. Utility of the Nitroblue Tetrazolium Reduction Test for Assessment of Reactive Oxygen Species Production by Seminal Leukocytes and Spermatozoa / N. Esfandiari, R.K. Sharma, R.A. Saleh [et al.] // Journal of Andrology.-2003. - Vol. 24. - № 6. 2. Шмелев Е.И. К оценке теста восстановления нитросинего тетразолия у хворих на хронічні захворювання легень / Е.Г. Шмелев, Т.К. Бумагина, Ю.Г. Митерев // Лабораторное дело.-1979. № 9. - С. 524-528. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 50 Спосіб виявлення та оцінка активності інфекційного запалення органів урогенітального тракту у чоловіків, що включає забарвлення в реакції зв'язування та відновлення нітросинього тетразолію до депозитів диформазану темно-синього кольору під впливом активних форм кисню при оксидативному стресі, який відрізняється тим, що визначають інтенсивність забарвлення в еякуляті з візуальною його оцінкою за 10-бальною шкалою з порівнянням забарвлення дослідного зразка з калібрувальним стандартом, який оцінюють від слабо-синього - 1 бал, до темно-синього кольору - 10 балів, при цьому інтенсивність забарвлення еякуляту більше 1 бала уможливлює виявлення та оцінку активності інфекційного запалення по інтенсивності забарвлення еякуляту до 10 балів органів урогенітального тракту, малодоступних для дослідження локалізацій. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3