Спосіб визначення рівня експресії білка

Реферат: Спосіб визначення рівня експресії білка включає отримання білкового лізату з біоптату пухлини, визначення кількості загального білка у ньому, електрофорез лізату у поліакриламідному гелі з подальшим переносом білків на мембрану, інкубацію з первинними моноклональними антитілами проти MGMT, з вторинними антитілами, візуалізацію результатів методом фотохімічної реакції і визначення рівня експресії білка. Додатково до отримання білкового лізату з біоптату пухлини частину біоптату ex tempore ріжуть, розбивають у поживному середовищі шприцем, фільтрують, об'єм проби стандартизують, суспензію ресуспензують і приблизно 20 мкл суспензії вносять до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього. Пробу суспензії переносять до камери Горяєва, проводять підрахунок живих і мертвих клітин, а за кількістю живих клітин оцінюють достовірність результату Вестерн блот аналізу та, відповідно, ступінь чутливості до алкілувальних хіміопрепаратів гліобластом - визначають рівень експресії білка як співвідношення мертвих і живих пухлинних клітин у зразку. UA 79476 U (12) UA 79476 U UA 79476 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, а саме до нейрохірургії і нейроонкології, та може бути використана для (діагностики) прогнозування чутливості пухлини до хіміопрепаратів з алкілувальним механізмом дії, а більш конкретно до способу визначення рівня експресії білка. Сучасний етап розвитку нейроонкології передбачає застосування у комбінованому лікуванні гліобластом хіміопрепаратів з алкілувальним механізмом дії. Так правильно вибрані показання (схеми) для лікування темозоломідом можуть гарантувати 2-річну тривалість життя 39 % пацієнтів віком 20-44 роки [Darefsky A.S., King J.T., Dubrow R. - Cancer.-2011-P. 47-50]. Важливим підґрунтям для визначення показань для призначення сучасних алкілувальних хіміопрепаратів є дослідження генетичних особливостей гліобластом. Тривалі досліди щодо визначення генетичних особливостей гліобластом у порівнянні з менш злоякісними гліомами та нормальною тканиною головного мозку показали наявність змін експресії деяких генів. Одним з них є ген MGMT, рівень експресії якого впливає на ефективність лікування алкілувальними хіміопрепаратами. Доведено, що відсутність білка MGMT у гліобластомі, є позитивним прогностичним критерієм при призначенні алкілувальних хіміопрепаратів [Riemenschneider M.J., Heqi M.E., Reifenberg G. MGMT promoter methylation in malignant gliomas // Target Oncol.-2010. Vol. 5, № 3. - P. 161-165]. Впровадження в нейрохірургію нових методів та технологій хірургічного лікування додають проблем при проведенні повторних нейрохірургічних втручань, особливо, коли перше втручання було зроблено за допомогою кібер-ножа (дія на пухлину невеликих розмірів направленим пучком гамма-променів). На жаль, такі методи не завжди є панацеєю і частина хворих повертається до лікаря з певними скаргами. Якщо приймається рішення про повторну операцію, то хірург видаляє вже більш гетерогенну за своєю структурою тканину. В ній можна сплутати тканину рубця. Помилково прийнявши її за тканину гліоми, провести дослідження з визначення рівня MGMT, отримати результат про відсутність експресії, але це буде помилково, тому що тканина рубця має щільну гомогенну структуру і складається зі специфічних білків, які не мають нічого спільного з білками пухлинних клітин. Відомий спосіб підрахунку живих клітин за допомогою трипанового синього, що включає отримання з біоптату клітинної суспензії, забарвлення трипановим синім, підрахунок кількості клітин у камері Горяєва. Однак, даний спосіб дозволяє оцінити якість зразка, але не рівень ензиму MGMT у ньому. Методикою, що дозволяє оцінити тканину, тобто однозначно заявити, що досліджуваний зразок тканини - це пухлина або рубець, є морфологічне дослідження. Ця методика полягає у забарвленні гематоксилін-еозином тонких зрізів зафіксованих у формаліні біоптатів пухлин і є широко розповсюдженою. Її недоліками є те, що вона дає результат тільки через декілька днів, потребує певної кількості реактивів і, головне, не дозволяє оцінити кількість та співвідношення помираючих і живих пухлинних клітин у зразку (хоча саме останні є мішенню хіміопрепаратів і у них визначається наявність MGMT). Найбільш близьким до пропонованої корисної моделі за сукупністю суттєвих ознак є Вестерн блот аналіз, що включає отримання білкового лізату з біоптату пухлини, визначення кількості загального білка у ньому, електрофорез лізату у поліакриламідному гелі з подальшим переносом білків на мембрану, інкубацію з первинними моноклональними антитілами проти MGMT з вторинними антитілами і візуалізацію результатів методом фотохімічної реакції [http://www.novusbio.coni/support/protocols/protocol-specific-for-mgmt-antibodv-nb100-168.html]. Однак, згаданий спосіб є недостатньо інформативним, оскільки не дозволяє оцінити якість пухлинних клітин і їх наявність. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу створення такого способу визначення рівня експресії білка, який би був більш інформативним та дозволив би оцінити якість пухлинних клітин і їх наявність. Поставлена задача вирішується пропонованим способом визначення рівня експресії білка, що включає отримання білкового лізату з біоптату пухлини, визначення кількості загального білка у ньому, електрофорез лізату у поліакриламідному гелі з подальшим переносом білків на мембрану, інкубацію з первинними моноклональними антитілами проти MGMT, з вторинними антитілами, візуалізацію результатів методом фотохімічної реакції і визначення рівня експресії білка, а, згідно з корисною моделлю, додатково до отримання білкового лізату з біоптату пухлини частину біоптату ex tempore ріжуть, розбивають у поживному середовищі шприцом, фільтрують, об'єм проби стандартизують, суспензію ресуспензують і приблизно 20 мкл суспензії вносять до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього, пробу суспензії переносять до камери Горяєва, проводять підрахунок живих і мертвих клітин, а за кількістю живих клітин оцінюють достовірність результату Вестерн блот аналізу та, відповідно, ступінь чутливості до 1 UA 79476 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 алкілувальних хіміопрепаратів гліобластом - визначають рівень експресії білка як співвідношення мертвих і живих пухлинних клітин у зразку. Запропонований спосіб здійснювали наступним чином. Визначали ділянки тканини пацієнта оперованого кібер-ножем для взяття зразка, брали зразок тканини, частину якого ex tempore різали ножицями, розбивали у поживному середовищі шприцом, фільтрували, об'єм проби стандартизували, суспензію ресуспензували і 20 мкл суспензії вносили до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього, потім пробу суспензію переносили у камеру Горяєва, проводили 6 підрахунок клітин живих і мертвих. Якщо кількість клітин у суспензії складала 0,5×10 /мл, то цей зразок вважали рубцевою тканиною, що містить мало живих клітин, бо з пухлинної тканини можна отримати значно більше клітин. Крім цього кількість клітин у таких зразках занадто мала, щоб можна було вважати результати Вестерн блот аналізу адекватними для усієї тканини пухлини. Іншу частину зразка тканини використовували для Вестерн блот аналізу та відповідно визначення ступеня чутливості до алкілувальних хіміопрепаратів гліобластом. Вестерн блот аналіз визначав наявність MGMT у певній кількості загального білка клітинного лізату. Якщо у зразку не виявлено MGMT, це означало, що пухлина буде чутливою до алкілувальних хіміопрепаратів. MGMT - ядерний білок, що присутній тільки у живих клітинах. Якщо більша частка загального білка представлена білками рубцевої тканини, MGMT може бути менше за поріг чутливості методу. Результат тоді буде хибно негативний, бо у зразку не було живих клітин. Для уточнення отриманих результатів і збільшення валідності проб автори запропонували досліджувати клітинний склад життєздатних фрагментів пухлин, за якими проводять генетичномолекулярне дослідження. Приклад 1. Хворий Ч., 44 років. Госпіталізований до Кібер-клініки Спіженка зі скаргами на головний біль, нудоту, блювання, епілептичні припадки. Хворим вважає себе близько 8 місяців. 3 місяця тому при МРТ-дослідженні виявлено новоутворення правої скроневої ділянки, що за характером росту схоже на злоякісні пухлину гліального походження. Місяць потому у Кіберклініці Спіженка проведено серію радіохірургічних операцій. Після них пацієнта продовжували турбувати головний біль, нудота і втрата свідомості. При МРТ-дослідженні виявлено новоутворення на тому ж місці, що розцінене як продовжений ріст. Проведене хірургічне видалення пухлини. Встановлено гістологічний діагноз: гліобластома з лікувальним патоморфозом. За результатами Вестерн блот аналізу зразка пухлини на MGMT і білка не було знайдено. Щоб достовірно оцінити якість клітин і їх наявність у зразку для прогнозу ефективності хіміотерапії, пацієнту був проведений запропонований спосіб визначення рівня експресії білка, що включав визначення ділянки тканини хворого для взяття зразка, взяття зразка тканини, частину якого ex tempore ріжуть ножицями, розбивають у поживному середовищі шприцом, фільтрують, об'єм проби стандартизують, суспензію ресуспензують і 20 мкл суспензії вносять до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього, потім пробу суспензії переносять у камеру Горяєва, проводять підрахунок клітин живих і мертвих, іншу частину зразка тканини використовувують для Вестерн блот аналізу. При підрахунку кількості живих клітин у суспензії 6 зразка виявлено 0,2×10 /мл. За результатом гістологічного дослідження видалена тканина представлена переважно післяопераційним рубцем. Результати підрахунку живих клітин запропонованим методом і гістологічне дослідження показало, що видалена тканина представлена переважно післяопераційним рубцем. При подальшому лікуванні темозоломідом пухлина виявилася хіміорезистентною. Отже, запропонований спосіб визначення рівня експресії білка дозволив швидко оцінити співвідношення мертвих і живих пухлинних клітин у зразку і на основі отриманих результатів підібрати пацієнту оптимальну схему лікування: комбінація променевої терапії з високими дозами темозоломіду. Приклад 2. Хворий Я., історія хвороби № 116829. Госпіталізований до клініки зі скаргами на головний біль, нудоту, блювання, епілептичні припадки. Хворим вважає себе близько 4 місяців. Одразу після першого епілептичного припадку звернувся до лікарні. При МРТ-дослідженні виявлено новоутворення правої скроневої ділянки, що за характером росту схоже на злоякісну пухлину гліального походження. У Кібер-клініці Спіженка проведено серію радіохірургічних операцій, але після них пацієнта продовжували турбувати головний біль, нудота і втрата свідомості. При повторному МРТ-дослідженні виявлено новоутворення на тому ж місці, що розцінене як продовжений ріст. Проведене хірургічне видалення пухлини. Встановлено гістологічний діагноз: гліобластома з лікувальним патоморфозом. 2 UA 79476 U 5 10 15 20 25 30 За результатами Вестерн блот аналізу зразка пухлини MGMT не було знайдено. Для прогнозу ефективності хіміотерапії був проведений спосіб визначення рівня експресії білка, що включав визначення ділянки тканини хворого для взяття зразка, взяття зразка тканини, частину якого ex tempore ріжуть ножицями, розбивають у поживному середовищі шприцом, фільтрують, об'єм проби стандартизують, суспензію ресуспензують і 20 мкл суспензії вносять до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього, потім пробу суспензії переносять у камеру Горяєва, проводять підрахунок клітин живих і мертвих, іншу частину зразка тканини використовувують для Вестерн блот аналізу. При підрахунку кількості живих клітин у суспензії 6 зразка виявлено 0,25×10 /мл. За результатом гістологічного дослідження видалена тканина представлена переважно післяопераційним рубцем. Результати підрахунку живих клітин запропонованим методом і гістологічне дослідження показало, що видалена тканина представлена переважно післяопераційним рубцем. При подальшому лікуванні темозоломідом пухлина виявилася хіміорезистентною. Так, результат Вестерн блот аналізу стає відомий через три-п'ять днів, в той час як за пропонованим способом - через одну годину. Отже, запропонований спосіб визначення рівня експресії білка дозволив швидко оцінити співвідношення мертвих і живих пухлинних клітин у зразку і на основі отриманих результатів підібрати пацієнту оптимальну схему лікування. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення рівня експресії білка, що включає отримання білкового лізату з біоптату пухлини, визначення кількості загального білка у ньому, електрофорез лізату у поліакриламідному гелі з подальшим переносом білків на мембрану, інкубацію з первинними моноклональними антитілами проти MGMT, з вторинними антитілами, візуалізацію результатів методом фотохімічної реакції і визначення рівня експресії білка, який відрізняється тим, що додатково до отримання білкового лізату з біоптату пухлини частину біоптату ex tempore ріжуть, розбивають у поживному середовищі шприцом, фільтрують, об'єм проби стандартизують, суспензію ресуспензують і приблизно 20 мкл суспензії вносять до 400 мкл 0,2 % розчину трипанового синього, пробу суспензії переносять до камери Горяєва, проводять підрахунок живих і мертвих клітин, а за кількістю живих клітин оцінюють достовірність результату Вестерн блот аналізу та, відповідно, ступінь чутливості до алкілувальних хіміопрепаратів гліобластом визначають рівень експресії білка як співвідношення мертвих і живих пухлинних клітин у зразку. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3