Спосіб визначення каріотипу у культуральних рослин міскантусу

Реферат: Спосіб визначення каріотипу культуральних рослин міскантусу включає використання ортооксихіноліну для скорочення хромосом та барвника ацетоорсеїну. При цьому використовують культуральні пагони міскантусу, яким проводять холодову обробку, стимуляцію поділу клітин, скорочення хромосом, мацерацію, за умови забарвлення - в краплі барвника на предметному склі. UA 79700 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ КАРІОТИПУ У КУЛЬТУРАЛЬНИХ РОСЛИН МІСКАНТУСУ UA 79700 U UA 79700 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі сільського господарства і може бути використана в сільськогосподарській біотехнології, селекції, рослинництві, зокрема для визначення каріотипу у вихідних матеріалів та відбору цінних селекційних ліній. Каріотип - набір хромосом, специфічний для кожного виду організмів, характеризується певною кількістю хромосом та особливістю їхньої будови. Зовнішній вигляд хромосом істотно змінюється протягом клітинного циклу. Протягом інтерфази хромосоми локалізовані в ядрі, як правило, деспіралізовані й важкодоступні для спостереження, тому для визначення каріотипу використовуються клітини в одній із стадій їх поділу - метафазі мітозу. Відомим і найбільш близьким до корисної моделі є спосіб визначення каріотипу у цукрових буряків на точках росту насінників та молодих листочках і первинних корінцях (Г.И. Ярмолюк., Э.И. Ширяева "Цитологические и цитогенетические исследования в селекции сахарной свеклы" Методические рекомендации / АН УССР. ВНИИС.: Киев:, Наукова думка. - С. 56). Даний метод базується на тому, що для фіксації використовують точки росту насінників, та молоді листочки і первинні корінці цукрових буряків, занурюючи їх в 0,03 % водний розчин орто-оксихіноліну упродовж 3 годин при кімнатній температурі, що забезпечує скорочення хромосом. В подальшому рослинні об'єкти промивають декілька разів дистильованою водою і заливають фіксуючим і мацеруючим розчином (2 частини 96 % - ного спирту і 1 частина концентрованої соляної кислоти) на 4-5 хвилин. Після мацерації, експлант знову промивають дистильованою водою 3-4 рази. Забарвлення рослинних об'єктів проводять на предметному склі під покривним скельцем 3 % оцтовокислим орсеїном 15-30 хвилин. Зайву фарбу відбирають фільтрувальним папером, утворюючи рівномірний мазок легким надавлюванням кінчиком сірника на покривне скло і підраховують хромосоми під мікроскопом. Відомий і пропонований способи визначення каріотипу мають спільні ознаки: використання 0,03 % орто-оксихіноліну для скорочення хромосом, розмір експланту 2-3 мм, барвник ацетоорсеїн 3 %. Проте, відомий спосіб визначення каріотипу у цукрових буряків на точках росту насінників, молодих листочках і первинних корінцях не забезпечує скорочення хромосом міскантусу, що в свою чергу не дозволяє провести їх підрахунок під мікроскопом. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб визначення каріотипу у культуральних рослин міскантусу, що дасть можливість зменшити час забарвлення рослинних об'єктів, удосконалити процес обробки та досягти скорочення хромосом для їх підрахунку. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі для фіксації використовують точки росту насінників та молоді листочки і первинні корінці цукрових буряків, занурюючи їх в 0,03 % водний розчин орто-оксихіноліну упродовж 3 годин при кімнатній температурі, що забезпечує скорочення хромосом. Рослинні об'єкти промивають декілька разів дистильованою водою і заливають розчином (2 частини 96 % - ного спирту і 1 частина концентрованої соляної кислоти) на 4-5 хвилин. Експлант знову промивають дистильованою водою 3-4 рази. Забарвлення рослинних об'єктів проводять на предметному склі під покривним скельцем 3 % оцтовокислим осеїном - 15-30 хвилин. Відбирають зайву фарбу фільтрувальним папером і підраховують хромосоми під мікроскопом. Запропонований спосіб визначення каріотипу у культуральних рослин міскантусу включає: використання пагонів міскантусу, які отримали клональним мікророзмноженням в культурі in vitro, через 1-2 тижні після пересаджування на свіже живильне середовище. Перед фіксацією рослинні пагони витримують в умовах холодильника 14-15 годин для гальмування поділу клітин. В подальшому колби виймають з холодильника і ставлять у культуральне приміщення за температури 22±2 °C на 3 години для стимуляції поділу клітин. Для фіксації беруть 2-3 пагони другого вегетативного покоління та фіксують їх, занурюючи у охолоджений 0,03 % розчин орто-осксихіноліну на 7-8 годин при кімнатній температурі. Промивають3-4 рази дистильованою водою по 3-5 хвилин та мацерують 7-8 хвилин у розчині, що складається з двох частин 96 % спирту і 1 частини концентрованої соляної кислоти. Рослинні об'єкти розміщають на предметне скло, голкою роблять розріз вздовж і виймають конус наростання, на який наносять краплю 3 % розчину оцтовокислого орсеїну і залишають на 5 хвилин, накривають покрівельним скельцем. В подальшому проводять підрахунок хромосоми під мікроскопом. Новими відмінними від існуючого найближчого аналога ознаками є: експлант - точка росту; холодова обробка - 14-15 годин; стимуляція поділу клітин - 3 години; скорочення хромосом - 7-8 годин; мацерація - 7-8 хвилин; 1 UA 79700 U 5 10 15 20 25 умови забарвлення - в краплі барвника на предметному склі; час забарвлення - 5 хвилин. Відмінні від найближчого аналога ознаки при взаємодії з відомими дозволяють за рахунок зменшення часу забарвлення рослинних об'єктів та проведення холодової обробки досягти скорочення хромосом для їх підрахунку. Ефективність нового способу визначення каріотипу культуральних рослин міскантусу вивчали на таких матеріалах: Sinensis, Late, Sachariflorus, New, Early. Згідно з проведеними результатами досліджень видно, що використання для культуральних рослин міскантусу холодової обробки за температури ±4 °C та експозиції 14-15 годин, та потім при освітленні за температури 22±2 °C і експозиції 3 години дає змогу синхронізувати поділ меристематичних клітин. Слід відзначити, що для кращого скорочення хромосом також доцільно збільшити час до 7-8 годин та мацерацію - до 7-8 хвилин, а час забарвлення зменшити до 5 хвилин. Важливим моментом є умови забарвлення, які доцільніше проводити в краплі барвника на предметному склі, а не підпокривним скельцем. Спосіб визначення каріотипу культуральних рослин міскантусу здійснюється таким чином: отримані клональним мікророзмноженням в культурі in vitro пагони міскантусу перед фіксацією витримують в умовах холодильника 14-15 годин для гальмування поділу клітин. В подальшому колби виймають з холодильника і ставлять у культуральне приміщення за температури 22±2 °C на 3 години для стимуляції поділу клітин. Для фіксації беруть 2-3 пагони другого вегетативного покоління та фіксують їх, занурюючи у охолоджений 0,03 % розчин орто-осксихіноліну на 7-8 годин при кімнатній температурі. Промивають 3-4 рази дистильованою водою по 3-5 хвилин та мацерують 7-8 хвилин у розчині, що складається з двох частин 96 % спирту і 1 частини концентрованої соляної кислоти. Рослинні об'єкти розміщують на предметному склі, голкою роблять розріз вздовж і виймають конус наростання, на який наносять краплю 3 % розчину оцтовокислого орсеїну і залишають на 5 хвилин, накривають покрівельним скельцем та підраховують хромосоми під мікроскопом. Таблиця 1 Спільні та відмінні показники визначення каріотипу у культуральних рослин міскантусу Показники Експлант Розмір експланту, мм Холодова обробка, ±4 °C Стимуляція поділу клітин, 22±2 °C Скорочення хромосом, години Орто-оксихінолін для скорочення хромосом, % Мацерація, хвилин Барвник Час забарвлення, хвилин Умови забарвлення 30 Відомий спосіб точки росту насінників або молоді листочки і первинні корінці 2-3 3 Запропонований спосіб 0,03 0,03 4-5 ацетоорсеїн 3 % 15-30 7-8 ацетоорсеїн 3 % 5 в краплі барвника на предметному склі під покривним скельцем точка росту 2-3 14-15 годин 3 години 7-8 Впровадження запропонованої корисної моделі дасть можливість зменшити час забарвлення рослинних об'єктів, удосконалити процес обробки та досягти скорочення хромосом для їх підрахунку. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб визначення каріотипу культуральних рослин міскантусу, що включає використання 0,03 % орто-оксихіноліну для скорочення хромосом, розмір експланту 2-3 мм, барвник ацетоорсеїн 3 %, який відрізняється тим, що використовують культуральні пагони міскантусу, яким проводять холодову обробку - 14-15 годин, стимуляцію поділу клітин - 3 години, скорочення хромосом - 7-8 годин, мацерацію - 7-8 хвилин, умови забарвлення - в краплі барвника на предметному склі, час забарвлення - 5 хвилин. 2 UA 79700 U Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3