Днк-вмісна субстанція з імуностимулювальною, ад`ювантною та протипухлинною властивостями

ДНК-вмісна субстанція, виділена з культуральної рідини бактерії Bacillus subtilis штаму 1MB В7108, яка має такі характеристики: речовина кислої природи; C2 1 3 79835 застосування такої ДНК та її синтетичних олігонуклеотидних аналогів для імунотерапії широкого кола захворювань: інфекційних процесів різноманітної етіології, алергічних хвороб та злоякісних новоутворень [6-10]. Деякі з отриманих на сьогодні результатів, зокрема стосовно застосування CpG ДНК в імунотерапії злоякісних новоутворень подають надію на можливість розробки нових більш дієвих підходів до лікування раку. У свій час CpG ДНК була виділена та апробована (лише в експерименті) з цілої низки мікроорганізмів, таких як, Escherichia coli, Lactobacillus delbrueckii, Staphylococcus aureus, Mycobacterium bovis, Actinobacillus actmomycetemcomitans, Porphyromonas gmgivalis, Peptostreptococcus micros, Streptococcus viridans, Neisseria polys accharea та ін. Деякі труднощі, пов'язані з виділенням та очисткою бактеріальної ДНК, а також із складністю отримання стабільного продукту змусили науковців працювати з синтетичними аналогами бактеріальної ДНК-CpG-олігодезоксинуклеотидами з певними імунобіологічними властивостями. Однак, не дивлячись на свою широку імуностимулюючу активність та високу молярну концентрацію імуностимулюючих послідовностей, бактеріальна ДНК все ж залишається ефективнішим імуностимулюючим агентом. Можливо, це пояснюється тим, що комбінація різноманітних імуностимулюючих послідовностей в складі ДНК є більш селективною, ніж короткі нуклеотидні послідовності заданого однотипного складу. В основу винаходу, що заявляється, були покладені дві основні задачі: розширення арсеналу біологічно-активних речовин природного походження з вираженою імуностимулюючою активністю та створення дієвого імуноад'юванта для підвищення ефективності застосування протипухлинних вакцин. Обидві поставлені завдачі були успішно вирішені за рахунок ДНК-вмісної субстанції з вираженими імуномоделюючою, ад'ювантною та протипухлинною властивостями, виділеної з культуральної рідини бактерії Bacillus subtilis з метою її подальшого імунотерапевтичного застосування. ДНК-вмісна субстанція, виділена з культуральної рідини Bacillus subtilis, на даний час не має подібних аналогів. Найбільш близькою до ДНК-вмісної субстанції, що заявляється, є ДНКвмісна фракція, отримана з Mycobacterium bovis BCG [11]. Однак, основні недоліки ДНК такого плану (високомолекулярної геномної) полягають у тому, що вона є досить високомолекулярною, а тому до її складу входять як імуностимулюючі, так і небажані імунопригнічуючі/імунонейтралізуючі послідовності, а також, що найголовніше, може містити значні кількості небажаних бактеріальних ендотоксинів, процес позбавлення від яких є технологічно складним. Крім того, процес її виділення та очистки також має цілу низку незручностей та вимагає використання високотоксичних речовин. На разі, у випадку ДНК-вмісної субстанції, що заявляється, йде мова про більш-менш короткі фрагменти геномної ДНК бактерії, які на певний термін культивування і у визначеній кількості з тих чи ін 4 ших причин вивільняються бактеріальними клітинами в культуральне середовище. ДНК-вмісна субстанція вперше виділена з культуральної рідини бактерії Bacillus subtilis штаму GP 1-807-03, задепонованого в колекції Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України під номером ІMB В-7108. Розчинена у воді ДНК-вмісна субстанція - це прозора рідина, яка зберігається при -20°С, при цьому необхідно уникати повторного заморожування; при розчиненні у спирті чи у ліофілізованому стані добре зберігається при 0-4°С без втрати вищезгаданої активності протягом 1 року. ДНК має типове світіння в ультрафіолетовому світлі при зв'язуванні з такими барвниками як бромід етидію та йодид пропідію. Зазначена субстанція є речовиною кислої природи. Вона досить гетерогенна за своїм складом і містить два основні компоненти у вигляді окремих фрагментів з величиною молекули 2650 та 3050 пар нуклеотидів (див. Фіг.1). Окрім того, субстанція, що заявляється, є чутливою до дії ДНКаз І та II, а також до специфічної рестрикційної ендонуклеази Нра II, що свідчить про збагачення її неметильованими CG-динуклеотидами (див. Фіг.1). Максимум поглинання в УФ спектрі - 260 нм, максимальні частоти поглинання в ІЧ спектрі (КВч): 850, 1100, 1700 та 2900см-1. Визначення гострої токсичності ДНК-вмісної субстанції на тваринах показало, що вона є помірно токсичною, але при комбінованому застосуванні здатна підвищувати токсичність інших субстанцій, наприклад, бактеріальних ЛПС. Токсичні прояви в умовах in vitro на культурах ліній клітин нирки мавпи Vero та лімфобластоїдних клітин МТ-4, а також на лімфоцитах мишей і людини не виявлені, навіть при застосуванні ДНК-вмісної субстанції у концентрації 50мкг/мл і вище. Речовина, що заявляється, володіє вираженою імуностимулюючою активністю (значно підвищує цитотоксичну активність лімфоцитів і природних кіперних клітин, фагоцитарну та метаболічну активність макрофагів, є потужним індуктором інтерферонів). Протипухлинну активність бактеріальної ДНК, що заявляється, визначали in vivo в профілактичних і терапевтичних (самостійно та комбіновано з протипухлинною глікопептидною аутовакциною) дослідженнях на тваринах. Застосування ДНКвмісної субстанції з культуральної рідини Bacillus subtilis GP 1-807-03 виявилось досить ефективним на багатьох пухлинних моделях різного гістогенезу (асцитна та солідна форми карциноми Ерліха та саркоми 37, лімфоїдна лейкемія L1210, метастазуюча меланома мишей В 16 та ін.). Крім того, у поєднанні з протипухлинною глікопептидною аутовакциною бактеріальна ДНК, що заявляється, здатна значно підвищува ти ефективність застосування останньої, що свідчить про її виражені ад'ювантні властивості. Про належність речовини, що заявляється, до нуклеїнових кислот, а власне до дезоксирибонуклеїнової кислоти, свідчить: 79835 а. максимум поглинання в ультрафіолетовому світлі - 260нм; б. типове світіння в ультрафіолетовому світлі при зв'язуванні з бромідом етидію; в. висока чутливість до нуклеолітичних (ферментів (ДНКаза І та ДНКаза II). Характеристику ДНК-вмісної субстанції бактеріального походження доповнюють приклади конкретного виконання та таблиці і фігури. Приклад Оскільки заявляється речовина з невизначеною структурою, наводимо детальний опис її отримання та ідентифікації. Змив з однодобової культури В. subtil is GP1807-03 вносять до поживного середовища (м'ясопептонний бульйон, середовище Luria-Bertani та ін.) і культивують протягом 8 діб при температурі 37°С. На 9-у добу культуральну рідину позбавляють від мікробних клітин шляхом дворазового центрифугування протягом 25хв при 8000g. Отримані супернатанти фільтрують через 0,2-мкм фільтри. До отриманого фільтрату культуральної рідини вносять поліетиленгліколь 6000 (12%) та NaСІ (0,6моль/л). Після цього фільтрат залишають на 16год за кімнатної температури. Центрифугування проводять при 10000 g протягом 25-30хв. Отримані осади ДНК розчиняли у 0,1М фосфатному буферному розчині (рН 7,3), її концентрацію визначали спектрофотометричне вимірюванням оптичної густини поглинання при 260нм. Співвідношення А260/А280 для всіх препаратів ДНК складало ³1,8. Ідентифікація ДНК у виділених препаратах здійснювалась також за допомогою електрофорезу у поліакриламідному гелі з використанням броміду етидію [12]. Присутність неметильованих CpG-мотивів визначалась за допомогою рестрикційного аналізу з використанням специфічної ендонуклеази Нра ІІ (Sigma, USA) [13] та наступним електрофорезом у поліакриламідному гелі. Для того, щоб підтвердити імуностимулюючу та протипухлинну активність одержаної ДНКвмісної субстанції були проведені наступні експериментальні дослідження, подані в таблиці 1 та на Фіг.2. 1. Дослідження імуностимулюючого впливу in vi vo ДНК-вмісної субстанції, ізольованої з фільтрату культуральної рідини Bacillus subtilis GP1-80703, на функціональну активність перитонеальних макрофагів мишей. Для цього мишам лінії Balb/c були внутрішньочеревне введені різні дози ДНК-вмісної субстанції, а на наступну добу було досліджено функціональну активність (у фагоцитарному тесті та тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест)) макрофагів перитонеального ексудату, вилучених з черевної порожнини цих мишей. В якості негативного контролю (тут і надалі) була використана ДНК з еритроцитів курчат, яка не містить у своєму складі імуностимулюючих CpG-мотивів, - так звана не-CpG ДНК. Результати були виражені у вигляді таких показників, як індекс Гамбурга (фагоцитарний індекс), індекс Райта (фагоцитарне число) та індекс НСТ-тесту. 6 Отримані результати проведених досліджень представлені у таблиці 1. Таблиця 1 Вплив ДНК-вмісної субстанції бактеріального походження національну на актив ність перитонеальних макрофагів Мишей Група тварин Тварини Тварини без пухлинопухлин носії 5 Доза ДНКвмісної субстанції, мкг/тварину Контроль 10,0 20,0 не-CpG ДНК, 20,0 Контроль 10,0 20,0 не-CpG ДНК, 20,0 Показник актив ності макрофагів Індекс Індекс Індекс ГамбурРайта НСТ,% га,% 56,3±2,7 2,7±0,1 87,3±4,6* 4,6±0,2* 74,0* 91,7±5,9 4,5±0,3** 31,0 50,5±3,5* 41,7±3,9 63,5±5,2* 74,0±6,0 2,4±0,2 2,2±0,2 2,9±0,1 3,3±0,2* 5,0** 62,0* 18,0 40,2±2,5 2,0±0,3* 1,0** * р