Цитотоксичний лектин з протипухлинною активністю

Цитотоксичний лектин з протипухлинною активністю, специфічний до фруктозо-1,6дифосфату, N-ацетилнейрамшовоі, Nгліколілнейрамшової і D-глюкуроновоі кислот, виділений з культуральної рідини штаму Bacillus subtihs 1MB В-7025, який має такі характеристики речовина кислої природи, максимум поглинання в УФ спектрі - 278 нм, максимум частоти поглинання в ІЧ-спектрі (КВч) 1260, 1410, 1540, 1680, 2860, 3300 см \ молекулярна маса поліпептидного ланцюга 7500 8500 дальтон, молекулярна маса нативної молекули 26000 дальтон, амінокислотний склад лізин - 2, аспарагінова кислота - 10, треонін - 6, серин - 4, глютамінова кислота -12, пролін - 3, гліцин - 4, аланін - 3, валін - З, ізолейцин - 3, лейцин - 3, тирозин - 7, фенілаланін - 1 , елементний склад, % С - 48,29, Н - 6,83, N - 9,65, О - 29,73, порошок коричневого кольору, розчинний у воді і водних розчинах етанолу та ацетону, лугах, нерозчинний в органічних розчинниках (етанолі, ацетоні, хлороформі, бутанолі, гексані, ефірі), дає позитивні кольорові реакції з амідо-чорним 10Б і кумасі діамантовим синім і негативні - з Суданом чорним В, шиф-йодною кислотою, толуїдиновим синім, дифеніламіном, фуксин-сернистою кислотою, термостабільний Винахід відноситься до біологічно активних речовин бактерійного походження з протипухлинною та цитотоксичною активністю Відомо, ЩО вуглеводзв'язуючі білки - лектини відносяться до біологічно активних речовин, що знаходяться в кожній біологічній системі, в кожному живому організмі Вони приймають участь в процесах вуглевод-білкового пізнавання і знаходять застосування в різних областях біологи і медицини Особливий інтерес для онкології викликають лектини, що продукуються сапрофітними бактеріями, які забезпечують внутрішні та МІЖКЛІТИННІ взаємодії, проявляють протипухлинні та імуномодулюючі властивості ВІДОМІ бактерійні лектини одержані з культуральної рідини штаму В subtihs 316 М та В роїутуха 102 КДУ [1] Однак дані лектини не можуть забезпечити необхідний рівень протипухлинної та цитотоксичної активності, яка в значній мірі залежить від штам у-продуцента Найбільш близьким аналогом до цитотоксич ного лектину з протипухлинною активністю, що заявляється, є позаклітинний сіалоспецифічний лектин сапрофітних бактерій [1], який ми беремо за прототип Прототип характеризується тим, що це глікопротеш з молекулярною масою 19-26кДа з високою гемаглютинуючою активністю та ступенем спорідненості до обох типів сіалових та уронових кислот, а також до фруктозо-1,6-дифосфату Термостабільний, стійкий до дм рН в діапазоні 4,8-9,1, відноситься до помірно й малотоксичних речовин з протипухлинною активністю по відношенню до злоякісних пухлин різного гістогенезу (лімфосаркома Пліса, саркома-45, карцинома Уокера, саркома 180, аденокарцинома молочної залози), з гальмуванням росту пухлини від 9 до 57,8% Його виділяють з культуральної рідини штамупродуцента В subtihs 668 1MB шляхом висолювання сульфатом амонію Однак відомий бактерійний лектин не забезпечує 100%-ну протипухлинну цитотоксичну активність, хоча і значно активніший за попередні ана О CO 00 ю 59483 4 (КВч) 1260, 1410, 1540, 1680, 2860, 3300см \ що є логи типовим для білків і поліпептидів Амінокислотний В основі винаходу, що заявляється, поставлесклад лектину лізин - 2, аспарагінова кислота -10, но задачу розширення арсеналу біологічно активтреонін - 6, серин - 4, глутамшова кислота - 12, них протипухлинних речовин бактерійного похопролін - 3, гліцин - 4, аланін - 3, валін - 3, ізолейдження цин - 3, лейцин - 3, тирозин - 7, фенілаланін - 1, Поставлена задача вирішена за рахунок цитовсього амінокислотних залишків - 63 токсичного лектину з високою протипухлинною активністю Елементний склад С - 48,29%, Н - 6,83%, N 9,65%, О - 29,73% Цитотоксичний лектин виділений з культуральної рідини штаму мікроорганізму В subtihs, депоЦитотоксичну активність лектину, що заявлянованого у колекції Інституту мікробіологи та вірується, по відношенню до пухлинних клітин визнасологи НАН України за номером В-7025 Даний чали in vitro в цитотоксичній реакції, а протипухлектин має досить високу цитотоксичну і протипулинну активність його визначали in vivo в профілахлинну активність по відношенню до пухлин різноктичних (в складі вакцини) і терапевтичних (самого гістогенезу У дослідженнях in vitro при концентстійно і в складі вакцини) дослідженнях на рації його 0,06-0,25мг/мл спостерігається 100% тваринах Гемаглютинуючу активність визначали цитотоксична активність по відношенню до 1,0x107 на еритроцитах миші і кроля в реакції гемаглютипухлинних клітин, а при вивченні протипухлинної нації Мінімальна концентрація лектину, яка приактивності in vivo в експерименті спостерігається зводить до аглютинації еритроцитів, знаходиться в гальмування пухлинного росту та подовження тримежах 0,15-0,04мг/мл, а мінімальний титр коливавалості життя тварин від 50% до 90% ється в межах 65536-262144ГЕ Лектин проявляє цитотоксичну активність по відношенню до пухЗавдяки цьому лектину розшириться арсенал линних клітин різного гістогенезу (саркома - 37, рак біологічно активних речовин з цитотоксичною і Ерліха, лімфома NK-Ly, лімосаркома ОН-2, плазпротипухлинною активністю моцитома ОН-3, меланома В-16, карцинома ЛьюРечовина, що заявляється, аглютинує і девііс) Він агглютинує, частково лізує і девіталізує талізує пухлинні клітини, а також аглютинує еритпухлинні клітини, підсилюючи при цьому їх імунороцити миші і кроля Про належність цієї речовини генність Ця властивість лектину, що заявляється, до класу пектинів свідчать м аглютинуюча активпокладена в основу приготування протипухлинної ність по відношенню до еритроцитів і пухлинних вакцини, яка може використовуватися при активній клітин, а також висока специфічність до певних специфічній імунотерапії в онкології вуглеводів При визначенні ступеню спорідненості лектину до вуглеводів встановлено, що він має високу специфічність до фруктозо-1,6-дифосфату, Nацетилнейрамшової, N-гліколілнейрамшовоі і Dглюкуронової кислот - інгібуючі РГА дози становлять 0,05мМ, 1,9мМ, 7,5мМ і 7,5 мМ ВІДПОВІДНО Цитотоксичний позаклітинний лектин виділений у вигляді аморфного порошку, коричневого кольору, добре розчинного у воді, лугах та органічних розчинниках Лектин дає позитивні кольорові реакції з амідо-чорним 10Б і кумасі діамантовим синім і негативні - з судаком чорним В, шифйодною кислотою, толуїдиновим синім, дифеніламіном, фуксин-сернистою кислотою Він добре зберігається при 0-5°С без втрати цитотоксичної активності на протязі 1-1,5 років, має високу термостабільність - прогрівання його протягом 1 години на киплячій бані не приводить до зниження цитотоксичної активності по відношенню до пухлинних клітин Визначення гострої токсичності лектину на тваринах показало, що він помірнотоксичний Зазначений лектин є речовина кислої природи Нативна молекула його має молекулярну масу 26000 дальтон і складається з трьох поліпептидних ланцюгів з молекулярною масою 8300 дальтон, які утворюють між собою асоціати, або ж знаходяться в розчині не тільки у вигляді мономера, але і у вигляді тримера, що схематично виглядить так 8300==-===-(Зх830О)=-=-==26500==(Зх 26500) » гидний моіекула 72000 тример Максимум поглинання в УФ спектрі - 278нм, максимальні частоти поглинання в ІЧ-спектрі Характеристику цитотоксичного лектину з протипухлинною активністю доповнюють приклад конкретного виконання та таблиці 1, 2 Приклад Оскільки заявляється речовина з невизначеною структурою, наводимо приклад м одержання 10% однодобової культури мікроорганізму штаму В subtihs В-7025 вносять в поживне середовище, культивують при 37°С протягом 7-9 діб, культуральну рідину центрифугують ЗОхв при 5000об/хв для відокремлення мікробних клітин До 1л центрифугату при постійному перемішуванні додають сульфат амонію до 70% насичення з наступним витримуванням до формування осаду Відцентрифуговании осад діалізують проти дистильованої води 3 діалізату по методу Блайя і Дайера [2] виділяють ліпофільні речовини, які знаходяться в хлороформовому шарі Воднометанольну фракцію концентрують під вакуумом і обессолюють гельфільтрацією на сефадексі G-25 Одержаний концентрат пропускають через сефадекс G-75, активні фракції збирають і висушують в вакуумі до сухої речовини В залежності від середовища на якому культивують штам-продуцент, вихід лектину з 1л культуральної рідини становить м'ясо-пептонний бульйон - 9,3-10,0мг/л, середовище Гаузе - 18,420,0мг/л, екстракт пшеничних висівок - 30,0мг/л Виділена речовина аглютинує і девіталізує пухлинні клітини, а також аглютинує еритроцити миші і кроля Аглютинуюча активність одержаної речовини по відношенню до еритроцитів і пухлинних клітин, а також висока специфічність до фруктозо1,6-дифосфату, N-ацетилнейрамшовоі, Nгліколілнейрамшової і D-глюкуроновоі кислот (шп 59483 буючі РГА дози становлять 0,05мМ, 1,9мМ, 7,5мМ і 7,5мМ ВІДПОВІДНО) свідчать проте, що ця речовина належить до класу пектинів Цитотоксичний лектин виділений у вигляді аморфного порошку, коричневого кольору, добре розчинного у воді, лугах та органічних розчинниках Одержаний лектин дає позитивні кольорові реакції з амідо-чорним 10Б і кумасі діамантовим синім і негативні - з Суданом чорним В, шифйодною кислотою, толуїдиновим синім, дифеніламіном, фуксин-сернистою кислотою Він добре зберігається при 0-5°С, не втрачаючи цитотоксичну активність, має високу термостабільність - прогрівання його протягом 1 години на киплячій бані не привело до зниження цитотоксичної активності по відношенню до пухлинних клітин Одержаний лектин є речовиною кислої природи Нативна молекула його має молекулярну масу 26000 дальтон і складається з трьох поліпептидних ланцюгів з молекулярною масою 8300 дальтон, які утворюють між собою асоціати, або ж знаходяться в розчині не тільки у вигляді мономера, але і у вигляді тримера Максимум поглинання в УФ спектрі - 278нм, максимальні частоти поглинання в ІЧ-спектрі (КВч) 1260, 1410, 1540, 1680, 2860, 3300см 1 Амінокислотний склад лектину лізин - 2, аспарагінова кислота - 10, треонін - 6, серин - 4, глутамшова кислота - 12, пролін - 3, гліцин - 4, аланін - 3, валін - 3, ізолейцин - 3, лейцин - 3, тирозин - 7, фенілаланін - 1 , всього 63 амінокислотних залишків Проведені нами порівняльні дослідження біологічної активності заявленого лектину та лектину - прототипу подані в таблицях 1, 2 Таблиця 1 Цитотоксична активність лектину В subtihs В-7025 та лектину 668 по відношенню до пухлинних клітин саркома-37 Концентпухлинрація них КЛІ- лектину, ТИН в 1мл мг/мл КІЛЬКІСТЬ Лектин В subtihs В-7025 1,0x107 (заявлений) В subtihs 668 1,0x107 (прототип) Цитотоксична активність, % 0,06-0,25 100,0 0,5 25,0 З наведених в таблиці даних видно, що цитотоксична активність лектину В-7025 в 4 рази перевищує активність лектину 668 Для того, щоб підтвердити протипухлинну активність одержаного лектину були проведені експериментальні дослідження (табл 2) Мишам лінії BALB/c прищеплювали підшкірно по 3,0x10б пухлинних клітин саркоми-37, лікування проводили трикратно (на 1, 4, 9 добу) протипухлинними вакцинами, виготовленими з пухлинних клітин саркоми-37 за допомогою лектину В subtihs В-7025 та лектину В subtihs 668 - прототипу, з розрахунку 1,0x107 пухлинних клітин + 0,15мг лектину В subtihs В-7025, 1,0x107 пухлинних клітин + 1,0мг лектину В subtihs 668 Результати оцінювали по гальмуванню пухлинного росту в порівнянні з контрольною групою та середній тривалості життя (СТЖ) ПІДДОСЛІДНИХ тварин Таблиця 2 Порівняння ефективності протипухлинних вакцин, виготовлених з пектинів В subtihs В-7025 та В subtihs 668 Лектин В subtihs В-7025 (заявлений) В subtihs 668 (прототип) Контроль (фізіологічний розчин NaCI) Концентрація лек- Гальмування пухлинного росту, % тину в 1мл вакцина 15 добу на 22 добу ни СТЖ пухлиноносмв, діб Х±т t 0,15мг/мл 42,0±15,6* 38,6±15,3* 41,20±2,11 3,12* 1,0мг/мл 2,8±5,5 4,7±7,1 30,41 ±3,09 0,14 0 0 30,5±2,48 * - різниця з контролем статистичне суттєва (р