Спосіб гальмування розвитку раку ендометрія

Реферат: Спосіб гальмування розвитку раку ендометрія шляхом трансфекційного введення siPHK у пухлинні клітини. Через 20-30 хвилин після змішування пухлинних клітин раку ендометрія з сумішшю для трансфекції, яку отримують шляхом інкубації 4 мкл розбавленого реагенту трансфекції Turbofect з 1 мкл siPHK при кімнатній температурі впродовж 20 хвилин, 6 перевивають 0,5 мл отриманої пухлинної суспензії у концентрації 5-6·10 кл/мл підшкірним введення самицям щурів у ділянку спини між передніми лапками. Через тиждень після перевивання вимірюють ортогональні розміри пухлини та розраховують її об'єм. Після виведення тварин з експерименту виконують морфологічні та імуногістохімічні дослідження зразків пухлини і при виявленні у вилучених зразках морфологічних ознак апоптозу та кількості маркерів апоптозу р53 і Кі-67 вище норми констатують здатність siPHK активізувати апоптоз пухлинних клітин і таким чином гальмувати розвиток раку ендометрія. UA 79999 U (54) СПОСІБ ГАЛЬМУВАННЯ РОЗВИТКУ РАКУ ЕНДОМЕТРІЯ UA 79999 U UA 79999 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області медицини, а саме до онкогінекології, і може бути використана для гальмування розвитку раку ендометрія. У регуляції процесів тканинного гомеостазу і патогенезі проліферативних захворювань важлива роль належить не лише посиленню процесів клітинної проліферації, але й порушенню регуляції клітинної загибелі. Резистентність клітин ендометрія до запрограмованої клітинної загибелі (апоптозу) призводить до накопичення змінених і надлишково проліферуючих клітин. Це характерна властивість неопластичних змін ендометрія. Апоптоз клітини починається з того моменту, коли відбувається пошкодження ДНК, що викликає перерву в циклі її репродукції. Якщо не відбувається «ремонт» ДНК, клітини вступають у фазу апоптозної загибелі. Коли генетичні механізми, які залучені до цього процесу, змінюються, смерть клітини може не настати. Подальші мутації призводять до появи злоякісного фенотипу і до зростання злоякісної пухлини [1]. Винайдення способів активізації та регуляції механізмів апоптозу при онкологічних захворюваннях важливо для вдосконалення їх терапії. Одним із таких способів є введення генетичного матеріалу, такого як ДНК та РНК, у пухлинні клітини трансфекційним методом. Відомо, що РНК являє собою короткочасну копію кодованої генетичної інформації у всіх організмах, служить моделлю при синтезі білків і, на відміну від ДНК, має всі передумови для отримання придатного вектора для перенесення екзогенної генетичної інформації in vivo. Крім того, РНК як носій генетичної інформації має численні переваги в порівнянні з ДНК, до яких належать наступні: 1) РНК, інтрадукована в клітину, не інтегрується в геном (в той час як ДНК у певній мірі інтегрується в геном і тим самим може вбудовуватися в інтактний ген генома клітинигосподаря, в результаті чого цей ген може піддаватися мутації, що може призводити до часткової або повної втрати генетичної інформації або появи помилкової інформації); 2) для ефективної транскрипції РНК не потрібно ніяких вірусних послідовностей, таких як промотори і т.п. (в той час як для експресії інтрадукованої у клітину ДНК потрібен сильний промотор (наприклад, промотор CMV (вірус мозаїки цвітної капусти). Інтеграція таких промоторів у геном клітини-господаря може призводити до небажаних змін регуляції експресії гена; 3) розщеплення інтродукованої РНК відбувається протягом обмеженого періоду часу (кілька годин - 11, 12), тому можна досягати короткочасної експресії гена, яку можна переривати після необхідного періоду обробки (в той час, як це неможливо у випадку ДНК, інтегрованої в геном); 4) РНК не призводить до індукції патогенних антитіл до РНК в організмі пацієнта (в той час, як відомо, що індукція антитіл до ДНК викликає небажану імунну відповідь). Нещодавно виявлена можливість інгібування експресії генів, заснована на створенні дволанцюжкових молекул РНК. За допомогою цих дволанцюжкових РНК (dsRNA) можна з високою ефективністю і більш швидко, ніж з використанням будь-якого іншого способу, націленим чином вимикати окремі гени без порушення утворення білків сусідніх генів. Принцип, що лежить в основі цього процесу, названий РНК-інтерференцією. dsRNA-послідовність, що зумовлюють вказаний феномен, називають siPHK (мала інтерферуюча РНК). siPHK не перешкоджає зчитуванню гена, але включає властивий клітині механізм, який паралізує зчитування з гена мРНК і таким чином перешкоджає утворенню відповідного білка (посттранскрипційний сайленсінг гена) [2, 3]. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб гальмування росту раку ендометрія шляхом прийому агоністів гонадотропін-релізинг гормонів (ГнРГ) [4]. Вказаний спосіб характеризується тим, що агоністи ГнРГ можуть впливати на проліферацію клітин ендометрія як непрямим шляхом - блокуючи гормональний вплив і викликаючи гіпоестрогенію, так і прямим - впливаючи in situ на рецептори до ГнРГ, що викликає десенситизацію або придушення синтезу рецепторів до ГнРГ і таким чином надає прямий антипроліферативний ефект, чим запобігає прогресії пухлинного росту. Однак недоліком цього способу є те, що через 6-12 місяців після відміни агоністів ГнРГ є вірогідність виникнення рецидиву захворювання. Це пояснюють недостатньою тривалістю курсів лікування, що обмежується несприятливим впливом препаратів цієї групи на мінеральну щільність кісткової тканини. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалення способу гальмування розвитку раку ендометрія шляхом трансфекційного введення siPHK у пухлинні клітини, що дозволить активізувати апоптоз пухлинних клітин і таким чином підвищити ефективність лікування раку ендометрія та інших проліферативних захворювань. Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з корисною моделлю, через 20-30 хвилин після змішування пухлинних клітин раку ендометрія з сумішшю для трансфекції, яку отримують шляхом інкубації 4 мкл розбавленого реагента трансфекції Turbofect з 1 мкл siPHK при кімнатній 1 UA 79999 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 температурі впродовж 20 хвилин, перевивають 0,5 мл отриманої пухлинної суспензії у 6 концентрації 5-610 кл/мл підшкірним введення самицям щурів у ділянку спини між передніми лапками і через тиждень після перевивання вимірюють ортогональні розміри пухлини та розраховують її об'єм, потім, після виведення тварин з експерименту, виконують морфологічні та імуногістохімічні дослідження зразків пухлини і при виявленні у вилучених зразках морфологічних ознак апоптозу та кількості маркерів апоптозу р53 і Кі-67 вище норми констатують здатність siPHK активізувати апоптоз пухлинних клітин і таким чином гальмувати розвиток раку ендометрія. Спосіб виконується наступним чином. Як експериментальна модель раку ендометрія була використана карцинома Герена класична модель низькодиференційної, неметастазуючої, солідної аденокарциноми тіла матки щурів, яка здатна в короткі строки інтенсивно прогресувати і призводити до значної смертності експериментальних тварин. Експеримент виконували на самицях щурів Вістар з масою тіла 160-180 г. Тварини були розподілені на дві групи. Перша група (n=15) була групою контролю, яким перевивали пухлинні клітин, що знаходились у середовищі RPMI 1640. До другої групи належали самиці щурів (n=15), яким перевивали пухлинні клітини, які були поміщені у середовище RPMI 1640 з реагентом трансфекції Turbofect (Fermentas) та siPHK (Thermo scientific, USA). Для виділення окремих клітин пухлинну тканину інкубували з колагеназою (в концетраціі 1 мкл/мл) протягом 1 години при температурі 37 °С, після чого її поміщали у Medicons і проводили додаткове розщеплення пухлинних клітин на апараті Medimachine. Пухлинні клітини фільтрували за допомогою шприца через насадку Steri Dual. Підраховували пухлинні клітини в 6 камері Гаряєва. Потім додавали до них середовище RPMI 1640 до концентрації 5-610 кл/мл. Для отримання трансфекційної суміші у стерильну пробірку до 4 мкл реагенту трансфекції Turbofect (Fermentas) додавали 100 мкл середовища DMEM з високим вмістом глюкози і перемішували, ретельно струшуючи, після чого витримували розбавлений реагент трансфекції при кімнатній температурі протягом 10-20 хвилин. До розбавленого реагенту трансфекції додавали 1 мкл siPHK (Thermo scientific, USA), акуратно перемішуючи за допомогою піпетки, та інкубували при кімнатній температурі протягом 10-20 хвилин, з метою сформування трансфекційних комплексів. Отриману суміш розбавляли 500 мкл культурального середовища RPMI 1640. Потім аспірували живильне середовище від пухлинних клітин і відразу ж замінювали розведеною сумішшю трансфекції. Рівномірно розподіляли трансфекційовані комплекси, обережно погойдуючи тарілку. Через 20-30 хвилин пухлинні клітини з введеними методом трансфекції siPHK перевивали самицям щурів підшкірно у ділянку спини між передніми лапками. Спостереження за тваринами виконували впродовж 14 діб, після чого щурів виводили з експерименту шляхом декапітації під легкою ефірною анестезією. Для наркозу використовували диетиловий ефір. Дослідження росту карциноми Герена починали на 7 добу після перевивання. З 7 по 14 день після інокуляціїпухлинної суспензії щоденно вимірювали розмір пухлини для оцінки динаміки збільшення об'єму in vivo. Заміряли ортогональні розміри пухлини за допомогою 3 2 штангенциркуля. Об'єм (см ) пухлини розраховували за формулою: V= ΑΒ /2, де: А найбільший діаметр пухлини, В - найменший діаметр пухлини. Коефіцієнт гальмування росту пухлини (ГРП) розраховували за формулою: ГРП=100 (VКVО)/VК, де: VК - об'єм пухлини у групі контролю, VО - об'єм пухлини у піддослідних групах [5]. Після виведення тварин з експерименту вилучали частину пухлини для подальших гістологічних та імуногістохімічних досліджень. Гістологічний матеріал фіксували в формаліні та поміщали в парафін. Парафінові блоки нарізали товщиною 3-4 мкм. Після депарафінізації і дегідратації отримані зрізи фарбували гематоксиліном і еозином. З метою визначення апоптозу в клітинах пухлини проводили мікроскопію зразків пухлини для виявлення морфологічних ознак апоптозу, а також використовували імуногістохімічні дослідження, тобто визначали наявність маркерів апоптозу р53 і Кі-67 [6]. У порівнянні з прототипом, заявлений спосіб гальмування розвитку раку ендометрія шляхом трансфекційного введення siPHK у пухлинні клітини, за рахунок дослідження у зразках пухлин самиць щурів морфологічних ознак та маркерів апоптозу, дозволяє з високою вірогідністю визначити вплив siPHK на активізацію апоптозу пухлинних клітин і таким чином - на гальмування розвитку раку ендометрія. 2 UA 79999 U 5 10 15 Джерела інформації: 1. Expression of the apoptosis-related genes Bcl-2 and p53 in clinical samples from endometrial carcinoma patients / I. Gonzalez-Rodilla, V. Verna, A.B. Munoz [et al.] // Anticancer Res. - 2011. - Vol. 31, № 12. - P. 4191-4193. 2. Amarzguioui M. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi / M. Amarzguioui, J.J. Rossi, D. Kim // FEBS Lett. - 2005. - Vol. 579, №26. - P. 5974-5981. 3. Кабилова Т.О. Ингибирование пролиферации опухолевых клеток человека двухцепочечными РНК, направленными на мРНК онкогенов семейства Мус / Т.О. Кабилова, Е.Л. Чериловская // Вестник ВОГиС. - 2006. - Т. 10, №2. - С. 373-381. 4. Effect of gonadotropin-releasing hormone-I agonist and gonadotropin-releasing hormone-II on endometrial carcinoma cell lines with different states of PTEN / L.J. Zhao, L.H. Wei, X.P. Li, J.L. Wang // Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. - 2009. - Vol.44, № 1. - P. 45-49. 5. Гальмування росту карциноми Герена у щурів після введення мезенхимальних стромальних клітин жирової тканин людини та біорегуляторів стовбурових та прогениторних клітин / Д.В. Черкащина, А.С. Лебединский, Ю.А. Петренко [и др.] // Журн. АМН України. - 2010. Т.16, № 3. - С 492-506. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 20 25 30 Спосіб гальмування розвитку раку ендометрія шляхом трансфекційного введення siPHK у пухлинні клітини, який відрізняється тим, що через 20-30 хвилин після змішування пухлинних клітин раку ендометрія з сумішшю для трансфекції, яку отримують шляхом інкубації 4 мкл розбавленого реагента трансфекції Turbofect з 1 мкл siPHK при кімнатній температурі впродовж 6 20 хвилин, перевивають 0,5 мл отриманої пухлинної суспензії у концентрації 5-6·10 кл/мл підшкірним введення самицям щурів у ділянку спини між передніми лапками і через тиждень після перевивання вимірюють ортогональні розміри пухлини та розраховують її об'єм, потім, після виведення тварин з експерименту, виконують морфологічні та імуногістохімічні дослідження зразків пухлини і при виявленні у вилучених зразках морфологічних ознак апоптозу та кількості маркерів апоптозу р53 і Кі-67 вище норми констатують здатність siPHK активізувати апоптоз пухлинних клітин і таким чином гальмувати розвиток раку ендометрія. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3