Спосіб визначення утворення тимчасового умовного зв’язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу

Реферат: Спосіб визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу включає формування умовної реакції, декапітацію, витяг головного мозку, відбір проб з його структур та визначення концентрацій лізосомних ферментів. Додатково відбирають проби фронтальної зони неокортексу, гіпокампа, медіальної частини таламуса, Варолієвого моста та смугастого тіла, підготовляють гомогенати з використанням трис-буферного розчину, в електрофотометричних умовах проводять обмінні реакції гомогенатів з 2-нафтиламід Lлейцином, за допомогою спектрофотометра й за гідролізом 2-нафтиламіду L-лейцину визначають концентрації лізосомного цистеїнового катепсину Н, як показники рівнів вільної активності клітин. Формування умовної реакції здійснюють шляхом світлового та електрошокового впливів. UA 82167 U (12) UA 82167 U UA 82167 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до визначення вимірів або реєстрації з діагностичною метою, та може бути використаною в теоретичній та клінічній психології, нейрофізіології або в невропатології. Відомий спосіб визначення активності мозку тварини, що включає формування умовної реакції пасивного уникнення, візуальну реєстрацію та хронометраж компонентів поведінки від початку навчання [1]. До причин, які перешкоджають досягненню очікуваного технічного результату відносяться візуальний характер реєстрації та хронометраж компонентів поведінки. Це зумовлене відсутністю кількісних показників під час візуальної реєстрації компонентів поведінки та суб'єктивним характером хронометражу. Від цього сукупність використовуваних приймань істотно впливає на достовірність кінцевого результату. Більш висока вірогідність кінцевого результату притаманна способу визначення активності мозку, що включає навчання тварини, декапітацію, витяг головного мозку, відбір проб, визначення концентрацій глікопротеїну NCAM у пробах і реєстрацію змін клітинних контактів за кількістю його експресії [2]. Кількісне визначення експресії глікопротеїну NCAM відбиває залежність концентрації білка, відповідального за процеси структурного синоптичного ремоделювання та аксонального зростання, від характеру поведінки тварини [3], а за більш високою компетентністю показника дещо збільшується інформативність. Більш наближеним до дійсної корисної моделі серед об'єктів аналогічного призначення за кількістю істотних ознак є спосіб визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу, що включає формування умовної реакції, декапітацію, витяг головного мозку, відбір проб з кори та гіпокампу головного мозку, визначення концентрацій кислої фосфатази, РНКази, катепсинів, як лізосомних ферментів до гемоглобіну, які характеризують активність клітин мозку [4]. Дослідження вільної активності чисельних лізосомних ферментів допускає збільшення інформативності, завдяки отриманню уявлень щодо рівня протеолізу катепсинів у корі й гіпокампі. Проте оцінка стану лише кори та гіпокампу, а також протеолітичної реакції до гемоглобіну стримує перевершення інформативності, з-поза відбиття сумарної активності вищезазначених лізосомних ферментів. В основу корисної моделі поставлена задача винайти такий спосіб визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу, застосування котрого сприяло б збільшенню інформативності шляхом залучення більш компетентних структур у формуванні пам'яті. Для досягнення вищезазначеного технічного результату у відомому способі визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу, що включає формування умовної реакції, декапітацію, витяг головного мозку, відбір проб з його структур та визначення концентрацій лізосомних ферментів, відповідно до корисної моделі, додатково відбирають проби фронтальної зони неокортексу, гіпокампа, медіальної частини таламуса, Варолієвого моста та смугастого тіла, підготовляють гомогенати з використанням трис-буферного розчину, в електрофотометричних умовах проводять обмінні реакції гомогенатів з 2-нафтиламід L-лейцином, за допомогою спектрофотометра й за гідролізом 2нафтиламіду L-лейцину визначають концентрації лізосомного цистеїнового катепсину Н, як показники рівнів вільної активності клітин, а формування умовної реакції здійснюють шляхом світлового та електрошокового впливів. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає в наступному. В основу корисної моделі поставлена задача яка надає реєстрацію слідів навчання за зміною проникності мембран лізосом після комбінаторного подразнення тварини світлом та електрошоком, яке прискорює формування умовної реакції. Оцінка вмісту лізосомного цистеїнового катепсину Н, як і протеолізу у фронтальній зоні неокортексу, гіпокампі, Варолієвому мості, медіальному таламусі та смугастому тілі відбиває зміни рівнів вільної активності катепсинів, як сліди формування нейрологічної пам'яті, та більш компетентно інформує про зміну рівнів проникності лізосомних мембран. Поставлена задача вирішується тим, що полягає у визначенні рівня вільної активності лізосомного цистеїнового катепсину Н у фронтальній зоні неокортексу, гіпокампі, Варолієвому мості, медіальному таламусі, смугастому тілі, які приймають участь у формуванні енграм пам'яті, а під час протеолізу та модифікації білків відбивають рівні кількісних змін цистеїнового катепсину Н і проникності мембран лізосом, що збільшує інформативність. Кількісне визначення його вмісту дозволяє оцінити ступінь, тривалість тимчасово-умовних зв'язків головного мозку в умовах реакцій протеолізу. Зміни концентрації вільного катепсину Н інформують про перебіг реакцій лізосомних протеїназ у формуванні, кодуванні та відтворенні слідів нейрологічної пам'яті, здебільше, на молекулярних, надмолекулярних, субклітинних і міжлітинних рівнях. 1 UA 82167 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Залучення 2-нафтиламід L-лейцину як протеолітичного ферменту, а також трис-буферного розчину націлене на каталіз реакції розщеплення лізосомного цистеїнового катепсину Н і якісну підготовку гомогенатів для визначення достовірної концентрації лізосомного цистеїнового катепсину Н, як показника рівнів вільної активності клітин. Відомості, які підтверджують можливість відтворення корисної моделі полягають в наступному. Для здійснення способу визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу залучають білих статевозрілих щурів, приміщення для їх подразнень, які складаються з великої освітленої та малої затемненої камер, з електрифікованими підлогами, що поєднані між собою круглим отвором. Для дослідження кількості катепсину Н застосовують трис-буферний розчин ("Sigma", USA), гідролізат 2нафтиламіду L-лейцину ("Koch-Light Laboratories", Англія) та спектрофотометр. Суть способу визначення утворення тимчасового умовного зв'язку головного мозку в умовах реакцій протеолізу полягає у формуванні у тварини умовної реакції на світлове і електрошокове подразнення, декапітації, витягу головного мозку, з наступним визначенням концентрацій лізосомних ферментів. Для збільшення інформативності способу залучають більш компетентні структури головного мозку у формуванні пам'яті. Відбирають проби фронтальної зони неокортексу, гіпокампа, медіальної частини таламуса, Варолієвого моста та смугастого тіла. Гомогенати підготовляють з використанням трис-буферного розчину "Sigma" (USA). Обмінні реакції гомогенатів проводять в електрофотометричних умовах, використовуючи 2-нафтиламід L-лейцин виробництва "Koch-Light Laboratories" (Англія). За результатом гідролізу лізосомного цистеїнового катепсину Н визначають його концентрації за допомогою спектрофотометра, які оцінюють як показники рівнів вільної активності клітин. Для перевірки інформативності способу був проведений експеримент (див. Табл.). Перед формуванням умовної реакції, щура розташовували в середині освітленої камери, хвостом до отвору, в темний відсік приміщення. Тварина вивчала освітлений відсік, знаходила отвір у темну камеру та переходила до неї. Латентний період такої реакції враховували як термін, від моменту розміщення щура в камері, до повного переходу у темну камеру. Через 15 с на підлогу камери подавали змінний імпульсний струм (тривалістю ~10 мс), інтенсивність стимуляції для кожного з щурів підбирали індивідуально, за порогом больової чутливості. Отвір між камерами залишали відчиненим. За щуром, який переміщувався до освітленої камери і намагався повернутися до темного приміщення спостерігали ~3 хв. Щурів, які повторно заходили до темної камери протягом ~3 хв, вилучали з експерименту. Через ~2 год., після вироблення пасивної оборонної навички, кожного з щурів піддавали електрошоковому впливу (I=200 мА, t=500 мс) для виклику амнезії та втрати умовної реакції. Протягом -72 год. спостерігали за поведінкою навчених щурів. Коли вони не відрізнялись від поведінки інтактних щурів, здійснювали перевірку збереження умовних реакцій. За результатами перевірки щурів розділяли на 2 групи: з амнезією, втратою навичок (30 %) та зі збереженням умовних реакцій (70 %). Після декапітації, у тварин вилучали головний мозок і виділяли фронтальну зону неокортексу, гіпокамп, Варолієв міст, медіальний таламус і смугасте тіло, які відбивають слід феномену пам'яті. Активність вільного катепсину Н, відповідно до корисної моделі, визначали у фронтальній зоні неокортексу, смугастому тілі, гіпокампі, медіальній частині таламусу та Варолієвому мості. Гомогенати (10 %) готували на 0,025 трис-буфері, послабленому Na-Сl (рН 7,40). Фактори активності досліджували електрофотометричним шляхом за гідролізом 2-нафтиламіду L-лейцину. Встановлено, що в різних структурах мозку у досліджуваних щурів при виробленні умовних реакцій відбувалися вірогідні зміни рівнів амінопептидазної активності катепсину Н як у щурів, які зберігали умовну навичку після електрошокового впливу, так і у амнезованих. Через ~72 год. спостерігали виражене посилення активності ферментів (р