Спосіб тривалого вирощування калюсної культури полину естрагон (artemisia dracunculus l.) in vitro

Реферат: UA 83951 U UA 83951 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології і стосується процесу довготривалого вирощування калюсних культур тканин лікарських рослин, а більш конкретно до способу тривалого вирощування калюсної культури полину естрагон (Artemisia dracunculus L.) in vitro. Спосіб може бути використано для отримання біологічно активних речовин. Крім того, оскільки відомо, що при тривалому культивуванні збільшується генетична гетерогенність популяції клітин калюсної культури, що сприяє збільшенню вірогідності отримання нових форм рослин за рахунок сомаклональної варіабельності, то цей спосіб також може бути використано в клітинній інженерії для одержання нових вихідних форм Artemisia dracunculus L. Відомий спосіб тривалого культивування, протягом більш ніж 10 років, штаму женьшеню (Panax ginseng С.А. Меу) БІО-2МК на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, що містить 2,0 мг/л нафтилоцтової кислоти та 1,0 мг/л кінетину (Кунах В.Α., Можилевская Л.П., Адонин ВИ., Губарь С.И. Продуктивность и генетическая структура клеточных популяций женьшеня Panax ginseng С. А. Меу в культуре in vitro / Биотехнология.-2003. - № 3. - С. 25-35). При цьому тривалість циклу вирощування складала 21-28 діб, а ростовий індекс коливався від 5,0 до 7,0. Недоліком цього способу є те, що він розроблений з урахуванням особливостей виду і спрямований на культивування цього штаму калюсу. Відомий спосіб культивування калюсної культури Artemisia annua L. (Пат. 2393217 Российская Федерация, МПК C12N5/04. Питательная среда для культивировании каллусной культуры Artemisia annua L. / Карначук Р.А., Медведева Ю.В., Дорофеев В.Ю., Песяк С.В.; патентообладатель Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования "Томский государственный университет" - № u2009100365/13; заявл. 11.01.2009; опубл. 27.06.2010). У зазначеному винаході для культивування калюсної культури Artemisia annua L. використовують живильне середовище Мурасіге і Скуга з додавання 30 г/л сахарози, 9 г/л агару та регуляторів росту 6-бензиламінопурину 0,2 мг/л та нафтилоцтову кислоту 0,5-1,0 мг/л. Згідно з цим способом індекс росту калюсної культури збільшується не більше ніж у 7,3 разів за 20 діб культивування, потім ріст калюсу припиняється. Недоліком цього способу є низький ростовий індекс, що мабуть пов'язане з недостатньо збалансованим складом живильного середовища. Відомий спосіб культивування калюсних тканин тирличу крапчастого та вибраний нами в якості прототипу (Пат. 23470 Україна, МПК А01Н 4/00. Спосіб вирощування калюсної тканини тирличу крапчастого (Gentiana punctata L. / Страшнюк Н.М., Леськова О.М., Мельник В.Н., Твардовська М.О.; патентовласник - Інститут молекулярної біології і генетики Національної академії наук України, Тернопільський національний педагогічний університет ім. Володимира Гнатюка - № u200700178; заявл. 09.01.2007; опубл. 25.05.2007, Бюл. № 7.) Згідно з цим способом, культивування калюсної культури тирличу крапчастого, проводять на живильному середовищі Мурасиге і Скуга з половинним вмістом макро- і мікросолей та з додаванням 0,1 мг/л 6-бензиламінопурину і 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксіоцтової кислоти. Відносний приріст сирої маси калюсу через 210 діб культивування складав 4,542±0,075. Недоліком цього способу є низький приріст маси калюсу в кінці циклу вирощування, що мабуть пов'язане з недостатньо збалансованим складом живильного середовища. В основу пропонованої корисної моделі поставлено задачу - розробити склад живильного середовища для тривалого вирощування калюсної культури полину естрагон (Artemisia dracunculus L.) in vitro з метою прискорення росту калюсних культур, скорочення тривалості циклу вирощування та високого виходу маси калюсу. Зазначена задача вирішується пропонованим способом вирощування калюсної культури Artemisia dracunculus L., який включає експлантацію, одержання калюсних тканин та вирощування калюсу на живильному середовищі за прописом Мурасіге і Скуга, що містить повну концентрацію макро- і мікроелементів, вітаміни, інозит, 20 г/л сахарози, 7 г/л агару та регулятори росту -0,5 мг/л 6-бензиламінопурину і 1,0 мг/л нафтилоцтової кислоти. У приготовленому рідкому середовищі доводять рН до 5,6-5,7, додають агар, розливають у пробірки, закупорюють ватно-марлевими пробками та автоклавують при 0,8 атм протягом 20 хвилин, охолоджують його до кімнатної температури. Потім в стерильних умовах на одержане живильне середовище висаджують калюс, при цьому маса транспланту складає 100-120 мг. Калюс культивують без пересадки протягом 45-50 діб в культуральній кімнаті при температурі 25-26 °C, 16-ти годинному фотоперіоді та 70 % вологості повітря. Здійснення способу підтверджується на прикладах. Приклад 1. Готують живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга, що містить повну концентрацію макро- і мікроелементів, вітаміни, інозит, 0,5 мг/л 6-бензиламінопурину, 1,0 мг/л нафтилоцтової кислоти, 20 г/л сахарози. У приготовленому рідкому середовищі доводять 1 UA 83951 U 5 10 15 20 25 30 35 кислотність до рН 5,6-5,7, додають агар з розрахунку 7 г/л, ретельно перемішують і розливають у пробірки, закупорюють ватно-марлевими пробками та автоклавують при 0,8 атм протягом 20 хвилин. Приготоване живильне середовище охолоджують до кімнатної температури. Потім в стерильних умовах на одержане живильне середовище висаджують калюс, при цьому маса транспланту складає 100-120 мг. Калюс культивують в культуральній кімнаті при температурі 25-26 °C, 16-ти годинному фотоперіоді та 70 % вологості повітря. Цикл вирощування калюсу складає 45-50 діб, протягом якого життєздатність популяції клітин калюсної культури досягає 85 %. При цьому ростовий індекс калюсної культури полину естрагон перспективного селекційного зразку № 5р.24 коливається в межах 8,07-20,59 в залежності від пасажу. Дані представлені в таблиці 1 свідчать про високу ефективність представленого способу тривалого культивування калюсних тканин полину естрагон перспективного селекційного зразку № 5р.24 на пропонованому середовищі протягом 20 пасажів. Приклад 2. Готують живильне середовище за прописом Мурасіге і Скуга, що містить повну концентрацію макро- і мікроелементів, вітаміни, інозит, 0,5 мг/л 6-бензиламінопурину, 1,0 мг/л нафтилоцтової кислоти, 20 г/л сахарози. У приготовленому рідкому середовищі доводять кислотність до рН 5,6-5,7, додають агар з розрахунку 7 г/л, ретельно перемішують і розливають у пробірки, закупорюють ватно-марлевими пробками та автоклавують при 0,8 атм протягом 20 хвилин. Приготоване живильне середовище охолоджують до кімнатної температури. Потім в стерильних умовах на одержане живильне середовище висаджують калюс, при цьому маса транспланту складає 100-120 мг. Калюс культивують в культуральній кімнаті при температурі 25-26 °C, 16-ти годинному фотоперіоді та 70 % вологості повітря. Цикл вирощування калюсу складає 45-50 діб, при цьому ростовий індекс калюсної культури полину естрагон перспективного селекційного зразку № 6р.14 коливається в межах 8,18-18,51 в залежності від пасажу. Дані представлені в таблиці 2 свідчать про високу ефективність представленого способу тривалого культивування калюсних тканин полину естрагон перспективного селекційного зразку № 6р.14 на пропонованому середовищі протягом 20 пасажів. Таким чином, запропонований спосіб тривалого вирощування калюсної культури полину естрагон (Artemisia dracunculus L.) in vitro на агаризованому живильному середовищі Мурасіге і Скуга, що містить повну концентрацію макро- і мікроелементів та з додаванням 0,5 мг/л 6бензиламінопурину, 1,0 мг/л нафтилоцтової кислоти, 20 г/л сахарози і 7 г/л агару дозволяє: 1) підвищити ростовий індекс сирої маси калюсу Artemisia dracunculus L. в 1,8-4,5 разів в порівнянні з прототипом, при цьому максимальне значення ростового індексу складає 18,5120,59 в залежності від селекційного зразку; 2) зменшити тривалість циклу вирощування до 45-50 діб. Таблиця 1 Приріст маси сирого калюсу полину естрагон селекційного зразку № 5р.24 в залежності від пасажу Пасаж IV VII XI XIII XVI XVIII XIX XX Маса сирого калюсу, мг 1486,20±105,50 1088,78±44,70 2507,25±105,38 2304,19±93,99 2252,88±107,92 2140,З8±125,44 2591,71±96,00 1449,06±153,63 40 2 Ростовий індекс 11,38±0,88 8,07±0,37 19,89±0,88 18,20±0,78 17,77±0,90 16,84±1,04 20,59±0,80 11,07±1,28 UA 83951 U Таблиця 2 Приріст маси сирого калюсу полину естрагон селекційного зразку № 6р.17 в залежності від пасажу Пасаж IV VII XI XIII XVI XVIII XIX XX Маса сирого калюсу, мг 1589,0±75,58 1101,86±51,20 1596,87±146,50 2227,62±165,27 1620,0±67,00 1652,4±120,81 2341,47±105,46 1695,94±81,44 Ростовий індекс 12,24±0,63 8,18±0,43 12,30±1,22 17,56±1,38 12,50±0,56 12,77±1,01 18,51±0,88 13,13±0,68 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 Спосіб тривалого вирощування калюсної культури полину естрагон (Artemisia dracunculus L.) in vitro, що включає експлантацію, одержання калюсних тканин, та вирощування калюсу на живильному середовищі Мурасіге і Скуга, який відрізняється тим, що вирощування калюсу проводиться на середовищі, яке містить повну концентрацію макро- і мікроелементів, 6бензиламінопурин у кількості 0,5 мг/л, а також додатково містить 1,0 мг/л нафтилоцтової кислоти та 7 г/л агару, тривалість циклу вирощування калюсної культури складає 45-50 діб. Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3