Спосіб визначення маси мембран клітин біологічної тканини

Реферат: Спосіб визначення маси мембран клітин біологічної тканини включає висічення шматочків тканини. Потім їх піддають фіксації в 1 % забуференому розчині тетраоксиду осмію та просочують тканину в суміші епоксидних смол і розміщують біологічну тканину в блоки. Блоки піддають полімеризації; з отриманих блоків виготовляють ультратонкі зрізи. Під електронним мікроскопом вибирають структури, що цікавлять, і фотографують їх. Визначають збільшення на кінцевих мікрофотографіях та вибирають конфігурацію тест-системи, що дозволяє виконати умову рівноймовірності зустрічі ліній тест-системи з досліджуваними мембранними компонентами. Визначають абсолютну питому поверхню досліджуваних мембранних структур та отримані числові значення абсолютної питомої поверхні обробляють статистично. Масу мембран клітин визначають шляхом множення числових значень абсолютної питомої поверхні на обчислене значення маси одного мікрометра зрізу мембрани видимого на електронній мікрофотографії. UA 84774 U (12) UA 84774 U UA 84774 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології і медицини, а саме до способів визначення маси мембран клітин біологічної тканини шляхом кількісного аналізу електронно-мікроскопічних зображень мембранних внутрішньоклітинних структур біологічних об'єктів. Біохімічними методами встановлено, що мембрани різних клітин біологічної тканини і їх органели складаються з різних компонентів. До складу мембран входять ліпіди (фосфоліпіди), білки, що мають глобулярну структуру, вуглеводи, неорганічні іони та вода. Основними структурними компонентами мембран є ліпіди, серед яких особливе місце займає холестерин. Невід'ємна частина мембрани - білки інтегральні (внутрішні), занурені в мембрану або пронизуючі її наскрізь. Загальна структура ліпідної матриці не порушується при взаємодії з різними білками. Структури, видимі на зрізі, суть поперечні перетини біліпідних шарів мембран. Довжина контурів і середня їхня поверхня обчислюється морфометричними методами. Морфометричні характеристики внутрішньоклітинних органел за своєю суттю є геометричними параметрами. Наприклад, об'ємна фракція - це частка об'єму цитоплазми, яку займають досліджувані структури в одиниці об'єму цитоплазми, абсолютна питома поверхня, що становить середню сумарну площу мембран цитоплазми, що знаходяться в одиниці об'єму, і інші характеристики біологічних структур [Автандилов Г. Г., Яблучанский Н. И., Губенко В. Г., Невзоров В. П., Невзорова О. Ф. Системная стереометрия в изучении патологического процесса. - гл. "Методические особенности стереометрического анализа ультраструктур биологических объектов". - Москва: Медицина, 1981.-190 с; Автандилов Г. Г., Невзоров В.П., Невзорова О.Ф. Системный стереометрический анализ ультраструктур клеток. - "Штиинца", 1984.-166 с; Невзоров В. П., Невзорова О. Ф. Медицинская морфометрия. - Гл. 10 "Ультраструктурометрия". - Москва: Медицина, 1990.-383 с.]. Існуючі методи виділення ультраструктурних компонентів клітин засновані на диференціальному центрифугуванні й вимагають тотального руйнування тканини, що не дозволяє судити про функціональний стан клітин і внутрішньоклітинних органел. Що стосується самого зважування, то відсутні технічні засоби (ваги), які б дозволили зважувати об'єкти масою -7 менше 10 г. Сучасні електронні мікроскопи, на відміну від світлових, дозволяють розглянути клітинну мембрану, товщина якої не перевищує 100 Å за умови правильної фіксації препарату й обробки його солями важких металів (урану або свинцю), що надають клітинним структурам здатність ефективно розсіювати електрони й тому вони стають більш помітними. За допомогою цієї техніки І.Л. Камерон зміг одержати електронно-мікроскопічні фотографії поверхні розрізів м'язів відразу після розсічення м'язових волокон через деякий час. Ніякої регенерації мембран не відбувалося [Линг Г. Физическая теория живой клетки: незамеченная революция. - СПб.: Наука, 2008.-376 с]. Даний спосіб визначення морфометричних характеристик біологічної тканини є найбільш близьким до того, що заявляється, за технічною суттю і результатом, який може бути досягнутим, тому його обрано за прототип. Основним недоліком найближчого аналога та відомих аналогів є те, що методи визначення маси внутрішньоклітинних структур дотепер не розроблені, що, імовірно, пов'язане з технічними труднощами виділення із цитоплазми певних мембранних компонентів у кількості, достатньому для прямого зважування. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу, який дозволяє, не прибігаючи до прямого зважування, визначити масу будь-якого ступеня малості одиниці площі біологічної мембрани за електронно-мікроскопічними зображеннями зрізів клітинних органел. Задачу, яку поставлено в основу корисної моделі, вирішують тим, що у відомому способі визначення маси мембран клітин біологічної тканини, що включає підготовку зразка біологічного об'єкта для візуалізації шляхом одержання електронно-мікроскопічної фотографії поверхні зрізу зразка з наступним вимірюванням за мікрофотографією морфометричних характеристик, згідно з корисною моделлю, шматочки тканини після висічення піддають фіксації в 1 % забуференому розчині тетраоксиду осмію; просочують тканину в суміші епоксидних смол і розміщують біологічну тканину в блоки; блоки піддають полімеризації; з отриманих блоків виготовляють ультратонкі зрізи; під електронним мікроскопом вибирають структури, що цікавлять, і фотографують їх; визначають збільшення на кінцевих мікрофотографіях; вибирають конфігурацію тест-системи, що дозволяє виконати умову рівноймовірності зустрічі ліній тестсистеми з досліджуваними мембранними компонентами; морфометричними методами визначають абсолютну питому поверхню досліджуваних мембранних структур; отримані числові значення абсолютної питомої поверхні обробляють статистично; а масу мембран клітин визначають шляхом множення числових значень абсолютної питомої поверхні на обчислене 1 UA 84774 U 5 10 15 20 25 30 значення маси одного мікрометра зрізу мембрани т 4, видимого на електронній мікрофотографії: -17 m4=14,8538·10 г/мкм. Технічний ефект корисної моделі, а саме розробка способу, що дозволяє, не прибігаючи до прямого зважування, визначити масу будь-якого ступеня малості одиниці площі біологічної мембрани за електронно-мікроскопічним зображенням зрізів клітинних органел, обумовлений синергізмом дій, за допомогою яких описаний спосіб, а також порядком їхнього виконання й умовами, при яких може бути виконана кожна дія. Теоретичною передумовою способу є те, що за сучасними уявленнями, біологічна мембрана складається з подвійного шару ліпідів (біліпідного шару) і пов'язаних з ним протеїнів, причому ліпіди в ній складають ~ 98 %. Виходячи із цього й враховуючи, що при фіксації чотириокисом осмію контрастується, в основному, ліпідна частина мембрани, на електронномікроскопічних мікрофотографіях представлена мозаїка розподілу ліпідів у клітині. Поперечний зріз мембрани - мономолекулярний шар молекул фосфоліпідів. Маса є фундаментальною 2 властивістю всіх відомих видів матерії, а енергія являє собою міру її руху. Вираження E  mc (де E - енергія, mc - швидкість світла) є математичним формулюванням основного для всієї сучасної фізики закону взаємозв'язку маси й енергії, що вказує на те, що не може бути матеріального об'єкта, що має масу, але не має в той же час енергії й навпаки. Спосіб виконують наступним чином: визначення маси мембран клітин включає підготовку зразка біологічної тканини для візуалізації шляхом одержання електронно-мікроскопічної фотографії поверхні зрізу зразка з наступним вимірюванням за мікрофотографією морфометричних характеристик. Для цього шматочки тканини після висічення піддають фіксації в 1 % забуференому розчині тетраоксиду осмію. Просочують тканину в суміші епоксидних смол і розміщують біологічну тканину в блоки. Блоки піддають полімеризації. З отриманих блоків виготовляють ультратонкі зрізи. Під електронним мікроскопом вибирають структури, що цікавлять, і фотографують їх. Визначають збільшення на кінцевих мікрофотографіях. Вибирають конфігурацію тест-системи, що дозволяє виконати умову рівноймовірності зустрічі ліній тест-системи з досліджуваними мембранними компонентами. Морфометричними методами визначають абсолютну питому поверхню досліджуваних мембранних структур. Отримані числові значення абсолютної питомої поверхні обробляють статистично. Масу мембран клітин визначають шляхом множення числових значень абсолютної питомої поверхні на обчислене значення маси одного мікрометра зрізу мембрани m 4, видимого на електронній 17 35 40 45 мікрофотографії: m4  14,8538  10 г/мкм. Обчислення значення маси одного мікрометра зрізу мембрани т 4, видимого на електронній мікрофотографії, виконують таким способом: Відомо, що ліпіди в мембранах представлені в основному фосфоліпідами, щільність яких 3 8 дорівнює   0,95 г/см . Молекулярна маса =10 . -24 Відомо, що множення молекулярної маси на 1,6607·10 г дорівнює середній масі молекули в грамах. Отже, маса однієї молекули фосфоліпіду дорівнює: m1  1 6607  10 24  108 г  16607  10 16 г , , Обчислюють середній об'єм мембрани площею в 1 см за формулою: m    v , де  - питома щільність ліпідів, v - об'єм мембрани. Враховують, що за даними електронної мікроскопії, товщина мембрани складає у 7 середньому 70 Å=7·10- см. Тоді середній об'єм одного квадратного сантиметру дорівнює: V  1см  1см  70  10 8 см  7  10 7 см3 . 2 Маса мембрани m2 площею в 1см дорівнює: m2  0,95 г / см2  7  10 7 см3  6,65  10 7 г . 2 Кількість молекул ліпідів N , розташованих у мембрані площею в 1 см , одержують, 2 розділивши масу мембрани m , площею в 1 см на масу однієї молекули m1 2 m2 6,65  10 7   4,0  109 m1 1,660  10 16 . Приймаючи до уваги, що молекули розташовані в мембрані у два шари, регулярно, на 1 см довжини зрізу мембрани, кількість молекул становить: N 50 2 UA 84774 U N  2  109  4,4721  10 4 2 . Отже, на одному сантиметрі поперечного зрізу мембрани розташовано 2n молекул ліпідів, 4 тобто 8,948·10 . Тоді маса m2 ряду молекул ліпідів на одному сантиметрі довжини поперечного зрізу мембрани дорівнює: n 5 m3  2n  m1  8,948  10 4  16607  10 16  14,8538  10 12 г . , Отже, маса одного мікрометра зрізу мембрани m4 , видимого на мікрофотографії, дорівнює: електронній m4  14,8538  10 17 м. 10 15 20 25 30 У підсумку виконаної сукупності дій (підготовка зразка, одержання мікрофотографії, визначення морфометричних характеристик, статистична обробка, виконання розрахунку) одержують потрібну величину маси біологічної мембрани в одиниці об'єму цитоплазми, видимої на електронній мікрофотографії. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення маси мембран клітин біологічної тканини, що включає підготовку зразка біологічного об'єкта для візуалізації шляхом одержання електронно-мікроскопічної фотографії поверхні зрізу зразка з наступним вимірюванням за мікрофотографією морфометричних характеристик, який відрізняється тим, що шматочки тканини після висічення піддають фіксації в 1 % забуференому розчині тетраоксиду осмію; просочують тканину в суміші епоксидних смол і розміщують біологічну тканину в блоки; блоки піддають полімеризації; з отриманих блоків виготовляють ультратонкі зрізи; під електронним мікроскопом вибирають структури, що цікавлять, і фотографують їх; визначають збільшення на кінцевих мікрофотографіях; вибирають конфігурацію тест-системи, що дозволяє виконати умову рівноймовірності зустрічі ліній тестсистеми з досліджуваними мембранними компонентами; морфометричними методами визначають абсолютну питому поверхню досліджуваних мембранних структур; отримані числові значення абсолютної питомої поверхні обробляють статистично; а масу мембран клітин визначають шляхом множення числових значень абсолютної питомої поверхні на обчислене значення маси одного мікрометра зрізу мембрани т 4, видимого на електронній мікрофотографії: m4  14,8538  1017 г/мкм. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3