Спосіб одержання вільних амінокислот з біологічної тканини

Cпосіб одержання вільних амінокислот з біологічної тканини шляхом подрібнення тканини, обробки сульфосаліциловою кислотою, центрифугування з наступним вилученням цільового продукту, який відрізняється тим, що тканину перед подрібненням висушують при температурі 60-70°С, а після подрібнення зважують та екстрагують у буферному розчині при фізіологічному значенні рН та температурі 70°С протягом 2 годин. (19) (21) 2000105649 (22) 04.10.2000 (24) 16.07.2001 (33) UA (46) 16.07.2001, Бюл. № 6, 2001 р. (72) Михайличенко Борис Валентинович, Мельниченко Валентин Петрович (73) Михайличенко Борис Валентинович, UA, Мельниченко Валентин Петрович, UA 40202 ну, наступною обробкою сульфосаліциловою кислотою, центрифугуванням та виділенням цільового продукту. За способом, який пропонується, біологічну тканину попередньо висушують при температурі 60-70 град, а після цього подрібнюють, зважують та екстрагують у буферному розчині за умов фізіологічного значення рН та температурі 70 град протягом 2 годин. Цей спосіб базується на явищі високої термостійкості амінокислот, що пов’язано з їх хімічною стійкістю. Так, параметри розкладу амінокислоти цистеїн складають 173 град, а тирозину - 344 град (Дроздова Т.В. Геохимия аминокислот.//М.:Наука,1977.-С.19). Спосіб виконують наступним чином. Біологічну тканину, з якої необхідно одержати вільні амінокислоти, висушують при температурі 60-70 град до постійної ваги. При цьому відбувається інактивація ферментів, що руйнують амінокислоти, та видалення вологи. Висушені тканини можна зберігати тривалий час. Надалі суху тканину подрібнюють, наприклад, на невеличкі шматочки, та зважують. Наважку розміщують у ємності для екстракції, доливають 0,1 М натрійфосфатний буфер рН 7,2-7,5 та екстрагують у термостаті при температурі 70 град протягом 2 годин. Динаміка виходу вільних амінокислот з біологічної тканини наведена на малюнку. Так, за умов проведення екстракції при 50 та 60 град повний вихід амінокислот з біологічної тканини настає через 3 год., що показано на фіг. 1 та фіг. 2. В той же час на фіг. 3 цього малюнку показано, що при температурі 70 град повний вихід вільних амінокислот відбувається вже через 2 години. Надалі екстракт змішують з рівним об’ємом 8% сульфосаліцилової кислоти для депротеінізації, центрифугують при 9000 об/хв 10 хв. і отримують цільовий продукт у вигляді супернатанту, який вилучають для подальших потреб. Якщо проводять аналітичну процедуру, то його змішують з цитратним буфером рН 2,2 та проводять хроматографічне визначення вільних амінокислот тканини. Приклад виконання способу. Біологічну тканину - наприклад, шкіру морської свинки вилучають під час гострого досліду, висушують у термостаті при 60 град. Висушену тканину подрібнюють скальпелем, роблять наважку, наприклад, 0,1 г, яку переносять у пробірку та екстрагують 0,1 М фосфатним буфером рН 7,4 при температурі 70 град протягом 2 годин. Надалі екстракт змішують з рівним об’ємом 8% розчину сульфосаліцилової кислоти, після чого центрифугують та отримують цільовий продукт. Для кількісного визначення у ньому амінокислот його змішують з цитратним буфером рН 2,2 та аналізують на амінокислотному аналізаторі "Біотронік LC-5001". Проведене дослідження показало, що у зразку шкіри наявне 14270,18 мгк/г вільних амінокислот, серед яких (мкг/г): аспарагінова амінокислота 316,93 треонін 538,88 серин 1055,9 глютамінова кислота 1099,97 пролін 3433,11 гліцин 1429,90 аланін 1226,05 цистін валін 675,01 метіонін 101,59 ізолейцин 243,6 лейцин 599,63 тірозин 267,47 фенілаланін 440,51 гістідін 724,08 лізін 808,92 аргінін 1308,63 Приклад 2. Біологічну тканину, наприклад, печінку, висушують у термостаті при 70 град. Висушену тканину подрібнюють, роблять наважку, наприклад, 5 г, яку заливають 20 мл 0,1 М фосфатного буферу рН 7,3 та екстрагують при температурі 70 град протягом 2 годин. Супернатант вилучають, додають до нього рівний об’єм 8% розчину сульфосаліцилової кислоти, після чого центрифугують та отримують цільовий продукт. Таким чином, розроблений нами спосіб має такі переваги: 1. дозволяє вилучити вільні амінокислоти тканин; 2. попереднє висушення біологічної тканини дозволяє об'єктизувати дані про рівень вільних амінокислот при співставленні різних тканин; 3. об’єкти, з яких одержують амінокислоти, можна зберігати у сухому вигляді; 4. спосіб значно простіший у виконанні. 2 40202 Фіг. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3