Спосіб виявлення лужної сфінгомієлінази і набір, використовуваний у такому способі

1. Спосіб in vitro виявлення лужної сфінгомієлінази в пробі біологічного матеріалу пацієнта, що включає наступні стадії: а) суспендування вказаної проби в гомогенізуючому буфері, що містить 0,24-0,26М сахарозу, 0,14-0,16М КСl, 45-55мМ КН2РО4, доведеному до приблизно рН 7,4; 2 (19) 1 3 84839 4 c) центрифугування вказаної проби при 4000об./хв. і при +4°С протягом 60 хвилин; d) відділення супернатанту і його повторне центрифугування протягом 15 хвилин при 4000об./хв. і при +4°С; e) визначення вмісту білка в супернатанті за допомогою аналізу на білок Pierce з використанням бичачого сироваткового альбуміну як стандарту, де концентрація білка для кожної проби складає від 32мг/мл до 40мг/мл, і піпетування 25мкл кожної проби в ямку; f) додавання до кожної 25-мкл проби 65мкл аналітичного буфера, що містить 50мМ Трис/НСl, 2мМ EDTA, 0,15М NaCl, рН 9,0 і 10мкл 29мкМ сфінгомієліну, і додавання в аналітичний буфер солей жовчних кислот ТС, TDC, GC, GCDC в концентрації 3мМ; g) інкубування при 37°С протягом 1 години; h) піпетування 100 мкл кожної стандартної ліофілізованої бактеріальної сфінгомієлінази і 10мкл сфінгомієліну (29мкМ) з подальшим інкубуванням протягом 1 години при 37°С як проби; i) через 1 годину додання 100мкл реакційного буфера, що містить 50мМ Трис/HCl, рН 7,4, 10мМ βгліцерофосфату, 750мкМ АТР, 5мМ EDTA, 5мМ EGTA, 100мкМ червоного Amplex, 8Од/мл лужної фосфатази, 0,2Од/мл холіноксидази, 2Од/мл пероксидази хрону; l) інкубування реакційних сумішей протягом 1 години або більше при 37°С в захищеному від світла місці; m) вимірювання флуоресценції на флуоресцентному мікропланшетному рідері при збудженні в інтервалі 530-560нм і при детекції випромінювання при 590нм; n) для кожного значення, корекція з обліком фонової флуоресценції шля хом віднімання величин, отриманих для контролю, що не містить сфінгомієлінази. 5. Спосіб за п. 4, що застосовується до біологічних рідин. 6. Набір для виявлення лужної сфінгомієлінази в біологічному матеріалі, взятому у пацієнта, що включає тест-пробірки, які окремо містять зразки наступни х реагентів: a) сфінгомієлін, який повинен бути гідролізований лужною сфінгомієліназою, при 8,9-9,1, що присутня в калі або в біологічних рідинах, з утворенням фосфорилхоліну; b) лужна фосфатаза для каталізу гідролізу фосфорилхоліну в хо лін; c) холіноксидаза для окислення холіну в пероксид водню; d) пероксидаза хрону для стимуляції реакції пероксиду водню; e) реагент «червоний Amplex» (10-ацетил-3,7дигідроксифеноксазин) з утворенням флуоресцентної сполуки резоруфіну, флуоресценція якого є маркером присутності лужної СМази в калі або в біологічних рідинах; і f) ліофілізована бактеріальна сфінгомієліназа для використання як стандартного концентрату; g) буфер для аналізу при рН 8,9-9,1, що містить EDTA; h) солі жовчних кислот TC, TDC, GC, GCDC; i) реакційний буфер, що містить EDTA і EGTA, βгліцерофосфату, і АТР. Даний винахід відноситься до аналітичного способу аналізу на присутність лужної сфінгомієлінази в калі або біологічних рідинах пацієнтів, потребуючих такого аналізу. Даний винахід також відноситься до набору для здійснення вказаного аналітичного способу. Більш конкретно, спосіб даного винаходу являє собою флуориметричний спосіб виявлення лужної сфінгомієлінази in vitro, яка, як буде детально описано нижче, є маркером серйозних патологічних станів, таких як рак товстої кишки і спадковий аденоматозний поліпоз. Фермент сфінгомієліназа (сфінгомієлінфосфодіестераза, СМаза) каталізує гідроліз сфінгомієліну з утворенням цераміду і холінфосфа ту. До цього часу було ідентифіковано три різних типи СМази (кислотний, нейтральний і лужний), які зустрічаються в декількох ізоформах, таких як - лізосомна кислотна СМаза (А-СМаза); - цитозольна Zn2+-залежна кислотна СМаза; - мембранна нейтральна магній-залежна СМаза (N-СМаза): - цитозольна магній-незалежна N-СМаза і - лужна СМаза. Було показано, що СМази грають певну роль в фізіологічних і патологічних процесах широкого ряду, включаючи: лізосомний гідроліз ендоцитозної CM; опосередковану церамідами передачу клітинного сигналу, атерогенез, термінальне диференціювання, зупинку клітинного циклу, апоптоз, запалення і регуляцію відповідей на стрес в еукаріотів. На відміну від кислотних і нейтральних СМаз, які звичайно присутні в клітинах в формі лізосомних і мембрано-асоційованих ферментів, відповідно, лужна СМаза виявляє тканинну і видову специфічність. У людей лужна СМаза присутня в слизовій кишечнику і в жовчі. Лужна СМаза утворюється в дванадцятипалій кишці, досягає високих рівнів в кишечнику, особливо в дистальній частині порожньої кишки, і присутня у великих кількостях в ободовій кишці і в прямій кишці. Вказана СМаза оптимально діє в лужному середовищі при рН 9,0, є Mg2+ незалежною, залежною від солей жовчних кислот і резистентною до трипсину. Важлива роль лужної СМази в патологічних процесах була виявлена лише недавно, і цей факт був стимулом для проведення ряду досліджень, основаних, головним чином, на наступних міркуваннях. По-перше, фермент може бути відповідальним за гідроліз харчового сфінгомієліну, присутнього, в 5 84839 основному, в молоці, яйцях, м'ясі і рибі. По-друге, цей фермент може регулювати абсорбцію холестерину. По-третє, присутність лужної СМази по всьому кишковому тракту і селективне зниження її рівня, що виявляється в колоректальних карциномах, дає підставу передбачати, що цей фермент грає певну роль в кишковому канцерогенезі, оскільки при певних фізіологічних умовах він стимулює апоптоз і захищає слизову кишечнику від канцерогенезу. Дослідження, що проводилися раніше, також показали, що при фізіологічних умовах лужна СМаза дисоціюється під дією солей жовчних кислот з мембрани слизової кишечнику в порожнину кишечнику. Однак, в патологічних умовах, коли концентрація солей жовчних кислот є аномально підвищеною, то дисоціація лужної СМази під дією солей жовчних кислот може перевищувати біосинтез ферменту, що приводить до низького рівня активності лужної СМази в слизовій і до аномально підвищеної екскреції ферменту в фекаліях або в біологічних рідинах, тобто в жовчі. Отже, надлишок лужної СМази, виділеної в калі або в біологічних рідинах, що перевищує нормальні базальні значення, може інтерпретуватися як цінний діагностичний маркер колоректальної карциноми і спадкового аденоматозного поліпозу, а тому необхідно розробити надійний аналіз для виявлення лужної СМази в калі або в біологічних рідинах пацієнтів з підозрою на вищезазначені патології кишкового тракту. Крім того, деякі бактерійні штами (наприклад, Streptococcus thermophillus Lactobacillus) містять високі рівні СМази, і аналіз на лужну СМазу може забезпечити спосіб оцінки змін числа вказаних бактерій, наприклад, після лікування пробіотичними засобами і/або продуктами на основі про біотичних засобів. Вже відомі розроблені раніше методи аналізу на лужну СМазу. Активність СМаз може бути визначена або in vivo з використанням клітин, мічених радіоактивним попередником CM, з подальшим визначенням рівнів міченого продукту, або in vitro з використанням радіоактивно міченого CM або хромогенного аналога CM або забарвлених і флуоресцентних похідних нейтрального CM. Ці відомі і широко використовувані аналізи повністю не задовольняють сучасні вимоги, оскільки вони представляють потенційну небезпеку, внаслідок того, що вони є радіоактивними аналізами і при цьому менш чутливими, ніж флуориметричний аналіз. Метою даного винаходу є розробка надійного аналізу, що недорого коштує, на присутність лужної СМази в калі або в біологічних рідинах пацієнтів з підозрою на колоректальну карциному і спадковий аденоматозний поліпоз або на захворювання жовчного міхура або печінки, який подолає недоліки відомих методів. Іншою метою даного винаходу є о тримання аналітичного набору для використання у вищезазначеному аналізі. Іншою метою даного винаходу є аналіз на бактерійну колонізацію при різних станах здоров'я або вказаних нижче захворюваннях або при лікуванні 6 лікарськими засобами, або пробіотиками, або харчовими добавками. Метод флуориметричного непрямого аналізу даного винаходу заснований на нижченаведеній послідовності реакцій. Під дією лужної СМази, присутньої в фекаліях або в інших біологічних рідинах, сфінгомієлін гідролізується в церамід і фосфорилхолін, який під дією лужної фосфатази гідролізується з утворенням холіну. У присутності холіноксидази, холін продукує пероксид водню (H2O2). Ця остання сполука, в присутності пероксидази хрону, вступає в реакцію з 10 -ацетил-3,7дигідроксифеноксазином, чутливим флуорогенним зондом для H2O2 (який далі називається "реагентом червоним Amplex"), внаслідок чого утворюється сполука резоруфін з високою мірою флуоресценції. Флуоресценцію вимірюють з використанням флуориметра для визначення інтенсивності флуоресценції в мікропланшетах при збудженні флуоресценції при 530-560нм і детекції флуоресценції при 590нм. Аналітичний спосіб даного винаходу, оснований на вищезгаданій послідовності реакцій з використанням засобів для детекції флуоресценції, і що застосовується для аналізу на лужну СМазу, включає нижченаведені стадії, які відносяться до аналізу калу. Однак, для фахівця в даній галузі очевидно, що цей спосіб, при відповідних рутинних модифікаціях може бути також з успіхом застосований і до біологічних рідин, таких як жовч. Такими стадіями є: 1) збір проби калу пацієнта і її сушіння; 2) зважування приблизно 3-4г висушеної проби і її суспендування в 20мл гомогенізуючого буфера, що містить 0,25M сахарози, 0,15M KCl, 50мМ KH2PO4, рН 7,4; 3) центрифугування вказаної проби при 4000об./хв. і при +4°C протягом 60 хвилин; 4) відділення супернатанту і його повторне центрифугування протягом 15 хвилин при 4000об./хв. і при +4°C; 5) визначення вмісту білка в супернатанті за допомогою аналізу на білок Pierce з використанням бичачого сироваткового альбуміну як стандарту, де концентрація цього білка для кожної проби складає від 32мг/мл до 40мг/мл, і піпетування 25мкл кожної проби в ямку; 6) додання до кожної 25мкл проби 65мкл аналітичного буфера, що містить 50мМ Тріс/НСІ, 2мМ EDTA5 0,15 M NaCl, рН 9,0 і 10мкл 29мкМ сфінгомієліну і додавання в аналітичний буфер солей жовчних кислот (TC, TDC, GC, GCDC) в концентрації 3мМ; 7) інкубування при 37°С протягом 1 години; 8) піпетування 100мкл кожного стандарту (див. нижче) і 10мкл сфінгомієліну (29мкМ) з подальшим інкубуванням протягом 1 години при 370C як і зразки; 9) через 1 годину, додання 100мкл реакційного буфера, що містить 50мМ Тріс/НСІ, рН 7,4, 10мМ β-гліцерофосфату, 750мкМ ATP, 5мМ EDTA, 5мМ EGTA, 100мкМ червоного Amplex, 8Од/мл лужної фосфа тази, 0,2Од/мл холіноксидази, 2Од/мл пероксидази хрону; 7 84839 10) інкубування реакційних сумішей протягом 1 години або більше при 37°C в захищеному від світла місці; 11) вимірювання флуоресценції на флуоресцентному мікропланшетному рідері при збудженні в інтервалі 530-560нм і при детекції випромінювання при 590нм; 12) для кожного значення, корекція з обліком фонової флуоресценції шляхом віднімання величин, отриманих для контролю, що не містить сфінгомієлінази. Даний винахід також відноситься до набору для виявлення лужної сфінгомієлінази в калі або в біологічних рідинах пацієнта відповідно до описаного вище способу, де вказаний набір містить тест-пробірки, в яких окремо містяться зразки наступних реагентів: a) сфингомієліну, який повинен бути гідролізований лужною сфінгомієліназою, присутньою в калі або в біологічних рідинах, з утворенням фосфорилхоліну; b) лужної фосфатази для каталізу гідролізу фосфорилхоліну в холін; c) холіноксидази для окислення холіну в пероксид водню; d) пероксидази хрону для стимуляції реакції пероксиду водню з е) реагентом червоний Amplex (10-ацетил-3,7дигідроксифеноксазином) з утворенням флуоресцентної сполуки резоруфін у, флуоресценція якого є маркером присутності лужної СМази в калі або в біологічних рідинах; і f) ліофілізованої бактерійної сфінгомієлінази для використання як стандартного концентрату. Для успішного здійснення аналітичного способу даного винаходу, крім вищезгаданих компонентів набору, можуть бути потрібні нижченаведені додаткові матеріали і обладнання: сахароза; хлорид калію (KCl); одноосновний фосфат калію (KH2PO4); основа Trizma; EDTA; хлорид натрію; тауро холат (TC); тауродезоксихолат (TDC); глікохолат (GC); глікохенодезоксихолат (GCDC); β-гліцерофосфат; динатрієва АТР-сіль; EGTA; реагент для аналізу на білок BCA; бичачий сироватковий альбумін; центрифуга з холодильником; мікропланшетний рідер, який дозволяє провести вимірювання при 550-562нм, і флуориметр для визначення інтенсивності флуоресценції в мікропланшетах. Для проведення кількісної оцінки активності СМази повинні бути зроблені нижченаведені вимірювання. 8 Побудова стандартної кривої Набір постачається зі стандартним препаратом СМази, він складається з бактерійного екстракту, що містить такий тип СМази, яка діє при рН 9. При цьому, повинні бути здійснені наступні операції. Для побудови калібрувальної кривої СМази стандартний концентрат розводять з отриманням серійних розведень. Стандартну СМазу розводять 1мл аналітичного буфера (рН 9,0), внаслідок чого отримують маточний розчин з концентрацією 96мОд/мл. У кожну пробірку піпетують 0,500мл аналітичного буфера. Маточний розчин використовують для отримання серійних розведень. Перед подальшим перенесенням вміст кожної пробірки ретельно змішують. Нерозведений стандарт служить як максимальний стандарт (96мОд/мл), і стандартна крива буде містити наступні концентрації (мОд/мл): 96-48-24-12-6-3. Буфер служить як нульовий стандарт (0мОд/мл). Типові стандартні криві На Фіг.1 представлена стандартна крива, яка приводиться лише з метою ілюстрації. Стандартна крива повинна бути побудована для кожної серії проб, що аналізуються. Розрахунок результатів Усереднюють подвійні показання для кожного стандарту іпроби і від них віднімають середні величини флуоресценції для нульового стандарту. Для вказаних стандартів будують графік флуоресценції в залежності від активності (мОд/мл) цих стандартів і викреслюють оптимальну криву. Для визначення активності СМази в кожній пробі, спочатку знаходять величину флуоресценції на осі у, і проводять горизонтальну лінію до стандартної кривої. З точки перетину опускають вертикальну лінію до осі χ і зчитують відповідну активність СМази. Описаний спосіб дозволяє провести аналіз на активність СМази in vitro; і цей спосіб був розроблений для виявлення лужної СМази в органічному зразку. Для специфічного аналізу на лужну С Мазу, у вказаному способі використовуються умови, які виявляють активність кислотної і нейтральної СМази. Дійсно: - гомогенізуючий буфер має нейтральний рН, але він не містить інгібіторів протеази і фосфатази для виключення нейтральної СМази, оскільки остання є чутливою до активності протеаз і фосфатаз, а тому інгібується цими ферментами; - в гомогенізуючому буфері відсутній MgCl2, що блокує активність Mg-залежної нейтральної СМази; - реакційний буфер містить β-гліцерофосфат і ATP для пригнічення, крім того, активності кислотної СМази при нейтральному рН, і в цьому буфері присутні високі концентрації EDTA і EGTA для інгібування нейтральної СМази. 9 Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 84839 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601