Спосіб виявлення збудника helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях

Реферат: Спосіб виявлення збудника Helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях включає біопсію слизової оболонки тіла і антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії, занурення біоптатів у діагностикуми швидкого уреазного тесту, оцінку результатів дослідження. Після біопсії біоптати занурюють у рідке середовище, що містить, мас. %: сечовина 2-4 індикатори: диметиловий жовтий 0,015-0,030 метиловий червоний 0,005-0,010 бромтимоловий синій 0,02-0,04 фізіологічний розчин решта, з візуальним спостереженням за зміною кольору діагностикуму в часі. UA 85459 U (54) СПОСІБ ВИЯВЛЕННЯ ЗБУДНИКА HELICOBACTER PYLORI ПРИ ШЛУНКОВО-КИШКОВИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ UA 85459 U UA 85459 U 5 10 15 20 25 30 Корисна модель належить до медицини, а саме до медичної мікробіології, ендоскопії та гастроентерології, і може бути використаною для швидкого виявлення бактерій Helicobacter pylori (H. pylori) в біоптатах слизової оболонки шлунка і реєстрації рН слизової шлунка. За даними літератури частка виявлення Н. pylori при хронічному гастриті, виразковій хворобі шлунка та дванадцятипалої кишки сягає 70-95 % [Циммерман Я.С. Гастродуоденальные заболевания и Helicobacter pylori-инфекция: общее обозрение проблемы / Я.С. Циммерман // Клиническая медицина.-2009. - № 5. - С. 9-15]. Відомо декілька методів виявлення Н. pylori. Ці методи поділяються на прямі, засновані на безпосередньому виявленні збудника захворювань, та непрямі - визначення продуктів його метаболізму. Як найближчий аналог можна навести біохімічний швидкий уреазний тест, що заснований на визначенні активності уреази Н. pylori в біоптаті слизової оболонки шлунка шляхом занурення його в рідке або гелеподібне середовище, що містить сечовину, індикатор та буфер. При наявності в біопсійному матеріалі уреази сечовина діагностикуму гідролізується до аміаку, який залужнює середовище, що змінює колір індикатора [Leodolter A. Current Standards in the Diagnosis of Helicobacter pylori infection / A. Leodolter, K. Wolle, P. Malfertheiner // Dig. Diseases.2001. - Vol. 19. - P. 116-122]. До переваг цього уреазного тесту необхідно віднести простоту виконання та швидкість. Разом з тим цей тест через різну ферментативну активність бактерій та різний ступінь обсіменіння тканин призводить до отримання хибно негативних результатів, що знижує достовірність діагнозу. Найближчим аналогом запропонованого способу є ендоскопічна рН-метрія, що проводиться з метою оцінки секреторної функції шлунка. Однак при її поєднанні з виконанням швидкого уреазного тесту значно збільшується тривалість ендоскопічного обстеження, а коштовне обладнання і постійна потреба у заміні рН-зoндів часто не дозволяє використовувати даний метод у сучасних умовах. В основу даної корисної моделі поставлена задача - підвищити чутливість даного швидкого уреазного тесту для виявлення Н. pylori, скоротити час на ендоскопічне обстеження та знизити вартість ресурсів для рН-метрії. Суть даної корисної моделі полягає в тому, що при приготуванні середовища для постановки швидкого уреазного тесту замість індикатора фенолового червоного, який має рН переходу забарвлення 6,6-8,0, використовують суміш індикаторів: диметиловий жовтий - 0,0150,03 %, метиловий червоний - 0,005-0,01 %, бромтимоловий синій - 0,02-0,04 %. Це дає змогу реєструвати рН біопсійного шматочка у широких межах - від рН менше 1,5 до 7,0 і більше (див. таблицю). 35 Таблиця Зміна кольору реагенту в залежності від його рН Інтервал рН 40 45 Колір реагенту рожевий червоний оранжевий жовтий жовто-зелений зелений Метод дозволяє поєднувати рН-метрію та визначати наявність Н. pylori у шлунку, а також оцінювати здатність слизової антрального відділу шлунка залужнювати шлунковий вміст, що потрапляє у дванадцятипалу кишку (ДПК), недостатність цієї функції, що є предиктором утворення виразки цибулини ДПК [Рапопорт С.И., Лакшин А.А., Ракитин Б.В., Трифонов М.М. рН-метрия пищевода и желудка при заболеваниях верхних отделов пищеварительного тракта / Под ред. академика РАМН Ф.И. Комарова. - М.: ИД МЕДПРАКТИКА.-208 с.], фіксується зміною кольору реагенту (див. таблицю) у перші 2-5 секунд спостереження. Спільною ознакою з аналогом швидким уреазним тестом є наявність в складі сечовини і індикатора, який змінює колір при гідролізі сечовини. Спільною ознакою з іншим аналогом внутрішньо шлунковою рН-метрією можливість реєструвати рівень рН слизової оболонки шлунка. 1 UA 85459 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Відмінною ознакою від аналога швидкого уреазного тесту є наявність в складі ще двох індикаторів, що дозволяє реєструвати не тільки підвищення рН, а й зниження рН в перші секунди спостереження, внаслідок нижчого від вихідного рівня значення рН біопсійного шматочка. Відмінною ознакою від іншого аналога внутрішньошлункової рН-метрії є спосіб виконання дослідження, а саме взяття біопсії, а не використання рН зонда. Застосування суміші індикаторів дозволяє одночасно визначати секреторну функцію шлунка, на що вказує рівень рН у цих відділах за визначеною шкалою переходу забарвлення, і з більшою чутливістю визначати активність уреази хелікобактерів, через наявність у діагностикумі сечовини. Спосіб виконують таким чином. Під час ендоскопії беруть 2 біоптати слизової оболонки шлунка (тіло та антральний відділ). Вміщують їх у флакони із середовищем для постановки швидкого уреазного тесту, які містять сечовину (2-4 мас. %), суміш індикаторів і фізіологічний розчин (решта). Починають відлік часу, спостерігаючи за зміною кольору середовища. Зміна кольору реагенту відображає рН слизової даних відділів, а зміна забарвлення на зелене свідчить про уреазну активність біоптату через наявність в ньому Н. pylori. При цьому діагностичне середовище готують наступним чином. У ступці перетирають 4 г сечовини, 0,04 г бромтимолового синього, 0,03 г диметилового жовтого і 0,01 г метилового червоного, доки не утвориться однорідна за кольором суміш. Одержану суміш розважують по 0,02 г у мікротитрувальні лунки або скляні флакони місткістю 10-15 мл, наприклад, у флакони з-під антибіотиків, закривають гумовими корками і завальцьовують алюмінієвими ковпачками. В такому вигляді діагностикум може зберігатися 3 роки. Для приготування середовища флакон відкривають, додають 0,5-1,0 мл фізіологічного розчину і розчиняють суміш. Щоб довести можливість досягнення позитивного ефекту було досліджено біопсійні зразки зі шлунків 96 хворих на хронічний гастрит та виразкову хворобу шлунка та дванадцятипалої кишки. Приклад 1 Під час ендоскопії взяли біоптати слизової оболонки тіла та антрального відділу шлунка. Їх помістили у флакони із діагностикумом уреазного тесту, які містять вищезазначені компоненти. Почали відлік часу, спостерігаючи за зміною кольору реагентів. Через 1 хв. навколо біопсійних шматочків жовте забарвлення змінилось на зелене. Час кінця переходу жовтого забарвлення у зелене у всьому об'ємі діагностикуму склав 3 хв. Приклад 2 Під час ендоскопії взяли два біоптати слизової оболонки тіла шлунка та антрального відділу. Обидва біоптати помістили у флакони із діагностикумами уреазного тесту, які містять вищезазначені компоненти. Почали відлік часу, спостерігаючи за зміною кольору реагентів. Протягом перших 5 с реагент з біопсійним шматочком з тіла шлунку змінив колір на червоний, що відображає рН в діапазоні 1,5-2,0. Час кінця переходу червоного забарвлення діагностикуму з біопсійним шматочком з тіла шлунка у зелене склав 4 хв. 10 с, а час кінця переходу жовтого забарвлення діагностикуму з біопсійним шматочком з антрального відділу шлунка у зелене склав 3 хв. 15 с. Приклад 3 Під час ендоскопії взяли два біоптати слизової оболонки тіла шлунка та антрального відділу. Обидва біоптати помістили у флакони із діагностикумами уреазного тесту, які містять вищезазначені компоненти. Почали відлік часу, спостерігаючи за зміною кольору реагентів. Протягом перших 2 с реагент з біопсійним шматочком з тіла шлунку змінив колір на рожевий, що відображає рН менше 1,5, а реагент з біопсійним шматочком з антрального відділу шлунку змінив колір на оранжевий, що відображає рН у діапазоні 2,0-4,0. Час кінця переходу забарвлення обох діагностикумів у зелене склав 2 хв. 40 с. Щоб довести ефективність діагностики хелікобактеріозу запропонованим способом, було досліджено біопсійні зразки зі шлунків 96 хворих на хронічний гастрит та виразкову хворобу шлунка та дванадцятипалої кишки. Позитивний результат уреазного тесту був одержаний при дослідженні біоптатів, взятих у 90 хворих, що підтвердилося при виконанні дихального уреазного тесту (ДУТ) цим хворим як контролю. Негативний результат запропонованого уреазного тесту було зафіксовано у 6 осіб, але у 2 осіб з негативними результатами швидкого уреазного тесту була виявлена наявність Н. pylori за допомогою ДУТ. У 3 осіб позитивний результат запропонованого швидкого уреазного 2 UA 85459 U 5 тесту не підтвердився при виконанні ДУТ. При порівнянні результатів інрагастральної рН-метрії запропонованого методу виявлено позитивний кореляційний зв'язок помірної сили. Таким чином, запропонований спосіб біохімічного виявлення Н. руlоrі та визначення рН біопсійних шматочків може використовуватись при рутинному ендоскопічному обстеженні хворих на хронічний гастрит та виразкову хворобу шлунка та дванадцятипалої кишки, зменшити тривалість ендоскопічного обстеження і вартість діагностики. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 10 15 Спосіб виявлення збудника Helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях, що включає біопсію слизової оболонки тіла і антрального відділу шлунка під час гастродуоденоскопії, занурення біоптатів у діагностикуми швидкого уреазного тесту, оцінку результатів дослідження, який відрізняється тим, що після біопсії біоптати занурюють у рідке середовище, що містить, мас. %: сечовина 2-4 індикатори: диметиловий жовтий 0,015-0,030 метиловий червоний 0,005-0,010 бромтимоловий синій 0,02-0,04 фізіологічний розчин решта, з візуальним спостереженням за зміною кольору діагностикуму в часі. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3