Спосіб визначення цитотоксичності водного середовища

Спосіб визначення цитотоксичності водного середовища, що включає використання біомаркера, який відрізняється тим, що як біомаркер використовують формений елемент крові риби, причому кров відбирають із хвостової вени, визначають кількість формених елементів лейкоцитів та за їх співвідношенням в контрольному і дослідному зразках здійснюють оцінку цитотоксичності водного середовища. (19) (21) a200801532 (22) 06.02.2008 (24) 26.01.2009 (46) 26.01.2009, Бюл.№ 2, 2009 р. (72) ГОНЧАРУК ВЛАДИСЛАВ ВОЛОДИМИРОВИЧ, UA, ВЕРГОЛЯС МАЙЯ РОЗМЕТІВНА, U A (73) ІНСТИТУТ КОЛОЇДНОЇ ХІМІЇ ТА ХІМІЇ ВОДИ ІМ. А.В.ДУМАНСЬКОГО Н АЦІОН АЛЬНОЇ АКАДЕМІЇ Н АУК УКРАЇНИ, UA (56) UA 55842 C2, 15.04.2003 UA 71793 C2, 15.06.2006 Гармаева С.Г. Исследование гематологических и 3 85493 95%. Таким чином, зменшення кількості лімфоцитів в крові риб району ріки А2 свідчить про забрудненість даної води токсичними речовинами, тобто, відображає тільки загальну картину впливу токсичних речовин на гематологічні показники крові. Як випливає з технічної суті способу [3], останній не передбачав визначення цитотоксичності водного середовища. Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб оцінки цитотоксичності водного середовища [U A, патент 55842, МПК 7 G01N 33/18, опубл. 15.06.2005, Бюл. №6] [4]. У способі [4] для визначення цитотоксичності водного середовища як біомаркер використовували ядерцевий біомаркер клітин досліджуваних тест-організмів. Набір тест-організмів включав рибу - карась сріблястий Carassius auratus gibelio. Об'єктом водного середовища була взята вода бутильована столового типу, позначена як «On1», «On2», «Оn3». Фізико-хімічні показники води (вміст кисню, рН, жорсткість) відповідали нормам для питної води. Відповідно до стандартної методики біотестування водних проб [Методы биоиндикации и биотестирования природних вод. Выпуск 2 // Под. ред. В.А. Брызгало, Т.А. Хорунжей. - Л.: Гидрометеоиздат, 1989. - 276c.] [5]., зразки столової води, які підлягали аналізу, попередньо зберігали протягом 1-3 діб у холодильнику (при температурі 5-8°С). Як контрольний зразок використовували артезіанську воду. Для кожного біотесту використовували ємності відповідно з нормами для біотестування. Ядерцевий біомаркер оснований на дослідженні ядерцевої активності клітин і характеризує функціональну зміну геномної активності (цитотоксичність). Аналізували повітряно-сухі цитологічні препарати тваринних клітин, забарвлених 50% розчином азотнокислого срібла. Під світловим мікроскопом (окуляри 10х, об'єктив 100х, загальне збільшення 1000х) визначали такі показники, число ядерець у клітини (nЯ), розмір одиночного ядерця (VІЯ), а також відсоток гетероморфних парних ядерець (ГПЯ). Для кожної проби підраховують число ядерець у 1500-1800 клітинах і визначають їх розмір у 200 клітинах при максимальному збільшенні світового мікроскопу. Показники ядерцевого біомаркера для контролю та кожної проби фіксували через 30, 90 і 180хв. після початку дії аналізованого водного зразка. На клітинному рівні водній зразки «On1», «Оn2», «Оn3» проявили цитотоксичність. Наприклад, для водного зразка «Оn2», для показників ГПЯ, nЯ та VІЯ відхилення від контролю (середнє значення) складало: 6,5%, 17,9% та 23,8%, відповідно. Таким чином, тільки зміна показників VІЯ, а саме величина відхилення від контролю, могла бути використана для оцінки цитотоксичності води «Оn2». Як недолік способу [4] можна відмітити недостатньо високу чутливість та інформативність. 4 В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб оцінки цитотоксичності водного середовища, в якому використання нової природи біомаркера, а саме, форменого елементу крові, забезпечило б підвищення чутливості та інформативності щодо оцінки цитотоксичності водного середовища. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб визначення цитотоксичності водного середовища, що включає використання біомаркера, в якому, згідно з винаходом, як біомаркер використовують формений елемент крові риби, причому кров відбирають із хвостової вени, визначають кількість формених елементів (лейкоцитів) та за їх співвідношенням в контрольному і дослідному зразках здійснюють оцінку цитотоксичності водного середовища. Нами вперше запропоновано для визначення цитотоксичності водного середовища, як біомаркера лейкоцитарної формули крові. Визначення повного набору формених елементів крові (незрілі форми (бласти, промієлоцити), мієлоцити, метамієлоцити, паличкоядерні нейтрофіли, сегментоядерні нейтрофіли, еозинофіли, базофіли, моноцити, лімфоцити) у досліджуваних риб, які перебували у контрольних та токсичних водних зразках, дозволяє одержати більш повну картину впливу токсичних речовин на тест-организм, на клітинному рівні. Це в свою чергу, підви щує чутли вість і інформативність способу, щодо оцінки цитотоксичності водного середовища. Спосіб реалізується наступним чином. В способі оцінки цитотоксичності водних зразків використовували наступний набір тесторганізмів - риби; - карась сріблястий, Carassius auratus gibelio; - золота рибка, Carassius auratus auratus; - карп, Cyprinus carpio; - лещ Abramis brama; Експеримент проводили за наступною схемою: відбирали дві або більш дослідних гр уп риб (в залежності від кількості дослідних водних зразків), по 6-10 особин із середньою довжиною 10-15см і масою 8-10гр. Як об'єкт дослідження брали водні зразки, які містили токсичні речовині (ксенобіотики). Для кожної дослідної групи використовували ємності (акваріуми) у відповідності із нормами біотестування. Дослідну групу розміщали у водні зразки, які були забруднені токсичними речовинами, а другу гр упу - у контрольну воду, та витримували протягом 96 годин. В якості контрольного зразка використовували підготовлену лабораторну воду (відстояна водопровідна вода), яка відповідала стандартним рівням гідрохімічних показників: вміст О2 у воді акваріумів становив 7,52±0,19мг/дм 3, СО2 - 2,34±0,13мг/дм 3, а значення рН - 7,64±0,13, температура складала 20±2°С [Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. М., 1991. - 29 с.] [6]. Після експозиції риби у водному зразку, через 96 год у всіх риб відбирали кров для цитологічного аналіза та готували препарати. Кров відбирали з хвостової вени, краплю крові наносили на попередньо знежирене предметне скло. Препарати ви 5 85493 сушували на повітрі, попереджуючи попадання пилу, фіксували в 96%-му етанолі 30хв. і знову висушували. Фіксовані препарати зберігались в сухому місці до проведення цитологічного аналізу. Препарати фарбували безпосередньо перед аналізом; на мазок наливали піпеткою 10-15 крапель готового барвника-фіксатора Мая-Грюнвельда, через 3-5 хвилин додавали по краплинам стільки ж води і продовжували забарвлення іще 1 хвилин, після чого барвник змивали дистильованою водою і мазок висушували на повітрі. На висушений мазок наливали свіжо приготований розчин барвника Романовського 2% на 8-15хв. (в залежності від температури в приміщенні), змивали барвник водою і мазок висушували. Цитологічні препарати аналізували під світловим мікроскопом із загальним збільшенням х1000. Кількість клітин, проаналізованих для кожної риби, складала 5000. Статистична обробка проводилася стандартними методами, токсичний ефект вважається дійсним при статистично достовірній різниці із контролем [Лакин Г.Ф, Биометрия. - М.: Высш. пік,, 1980. - 293 с.] [7]. Для визначення формули крові в чотирьох ділянках мазка підраховували близько 1250 клітин, ідентифікуючи їх за класифікацією, запропонованою Н.Т. Івановою [Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб. М.: Легкая и пищевая промышленность. - 1983. - 184 с.] [8], а потім підраховували відсоток кожного типу клітин. В периферичній крові риб виділяли наступні формені елементи: незрілі форми (бласти, промієлоцити), мієлоцити, метамієлоцити, паличкоядерні нейтрофіли, сегментоядерні нейтрофіли, еозинофіли, базофіли, моноцити, лімфоцити, та визначали їх кількість у крові риб, які перебували у контрольних та токсичних водних зразках. Визначені показники порівнювали між собою та за кількісними змінами (зменшення кількості лімфоцитів, 6 сегментоядерних нейтрофілів та збільшення еозинофілів, базофілів, палочкоядерних нейтрофілів, моноцитів в крові риб) оцінювали якість водного середовища за одержаними цитотоксичними показниками. Для кількісного визначення токсичного ефекту, за допомогою цитологічних показників клітин риб, а саме формули крові, нами були здійснені досліди з визначення впливу токсичних речовин на обрані показники (на лейкоцитарну формулу крові). У якості токсичних речовин було використано сульфат міді (0,57мг/дм 3) та бензидин (10мг/дм 3, 20мг/дм 3, 40мг/дм 3). Також було визначено цитологичним методом дію екотоксикологічних чинників, присутніх у водному середовищі річок Десна, Дніпр, Ворскла. Приклади реалізації за винаходом. Приклад 1 Визначали цитотоксичність водного розчину сульфату міді з концентрацією 0,57мг/дм 3, в перерахунку на Сu. Як тест-організм брали карась сріблястий, Carassius auratus gibelio, вагою 12-15гр., довжиною 8-10см. Відбирали по 6 особин; контрольну груп у (6 особин) вміщували у стандартну лабораторну воду та інкубували протягом чотирьох діб. Дослідну груп у (6 особин) вміщували у лабораторну воду, яка містила 0,57мг/дм 3 розчину сульфатуміді. Після закінчення інкубації у всі х риб відбирали кров із хвостової вени. Готували препарати крові, проводили цитологічні дослідження, як описано вище. В периферичної крові риби виділяли таки формені елементи: лімфоцити, моноцити, сегментоядерні нейтрофіли, паличкоядерні нейтрофіли, базофіли та еозинофіли. Кількісні показники формених елементів, середнє значення для 12 риб (6 контрольних, б дослідних) представлені в таблиці 1. Таблиця 1 КН CuSO4 Відхилення від контролю % лімфоц. 82,67 65,2 21,13 моноц. 3,80 9,67 154,5 Як видно із даних табл.1, водний зразок розчину сульфату міді з концентрацією 0,57мг/дм 3 значно змінював лейкоцитарну формулу крові. Для таких показників форменого елементу крові, як моноцити, паличкоядерні нейтрофіли, базофіли та еозинофіли відхилення (збільшення) від контрольної величини складало 154,5; 208,16; 102,8 та 181,81, відповідно, при цьому кількість лімфоцитів зменшилась по зрівнянні з контролем на 21,1З %. Слід відмітити, що така значна величина відхилення показників при досить невеликій концентрації міді, яка знаходиться на рівні ПДК (