Тест-система та спосіб контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії

1. Тест-система для контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії, що містить тромбопластин і розчин 0,025 М СаСl2, яка відрізняється тим, що вона додатково містить специфічні компоненти C2 2 (19) 1 3 тест базується на визначенні часу зсідання плазми крові під дією екзогенного тромбопластину і характеризує зовнішній шлях плазменного гемостазу та опосередковано вказує на рівень функціонально активного протромбіну [1, 2]. Відомо спосіб контролю ефективності лікування непрямими антикоагулянтами [3], що полягає у визначенні часу зсідання капілярної крові в тесті "протромбіновий час". При цьому протромбіновий час визначають з використанням стандартизованого за міжнародним індексом чутливості тромбопластину та молярного співвідношення кінцевої концентрації безводного хлориду кальцію до кінцевої концентрації безводного цитрату натрію, що складає від 1,5 до 2,0. Результати протромбінового часу представляють у вигляді міжнародного нормалізованого відношення (МНВ) за формулою МНВ=(ПЧхворого/ПЧконтроля)МІЧ, де ПЧхворого - протромбіновий час в капілярній крові хворого, ПЧконтроля протромбіновий час в капілярній крові здорової людини, МІЧ - міжнародний індекс чутливості тромбопластину. Підбір дози антикоагулянтів непрямої дії проводиться під контролем визначення МНВ, виходячи з того, що показник МНВ має бути в діапазоні від 2,0 до 4,0. Недоліком цього тесту є його чутливість до інгібіторів полімеризації фібрину, оскільки рівень протромбіну визначається за часом зсідання плазми крові. Тому було запропоновано, окрім МНВ, враховувати ступінь трансформації фібриногену, що залежить від точки максимального прискорення перетворення фібриногену [4], що в свою чергу ускладнює інтерпретацію отриманих результатів. Ще один недолік тесту "протромбіновий час" полягає у фізіологічній активації VII, X, V факторів зсідання крові під впливом тромбопластину з подальшою активацією протромбіну. Тобто цей тест лише опосередковано вказує на рівень функціонально активного протромбіну та залежить від вмісту та функціонального стану зазначених факторів зсідання крові та дії інгібіторів зовнішньої ланки системи зсідання крові [5]. Відомо, що окрім „протромбінового часу" для моніторингу лікування антикоагулянтами непрямої дії запропоновано використовувати тест „екариновий час", що базується на визначенні часу зсідання плазми крові під дією активатора протромбіну з отрути ефи піщаної (Echis carinatus) екарину, який здатний активувати протромбін та інші його похідні форми [6]. Найбільш близьким за технічним рішенням до об'єкту, що заявляється, є метод визначення "екаринового відношення" та часу зсідання крові. Кількість інгібіторів тромбіну чи антикоагулянтів в плазмі крові визначають за часом зсідання плазми крові, користуючись калібрувальною кривою та спеціально розробленими комп'ютерними програмами [7, 8]. Недоліком даного тесту є те, що рівень протромбіну визначається також за часом зсідання плазми крові, тобто, як і „протромбіновий час", він є високочутливим до інгібіторів полімеризації фібрину та до гепарину і гірудину, які вводяться комбіновано з антикоагулянтами непрямої дії при профілактиці тромбозів [9, 10]. 86856 4 В основу винаходу поставлена розробка тестсистеми та способу контролю ефективності лікування антикоагулянтами непрямої дії, максимально незалежного від дії екзогенних та ендогенних інгібіторів системи зсідання крові, що дозволить встановлювати безпосередній результат впливу дії антикоагулянтів непрямої дії: накопичення функціонально неактивних форм протромбіну. Суть винаходу полягає у порівнянні результатів активації протромбіну плазми крові тромбопластином та екамуліном (активатором протромбіну з отрути ефи багатолускової, Echis multisquamatis) з використанням хромогенного субстрату S2238, що дозволяє визначити вміст декарбоксильованого протромбіну плазми крові за рівнем екамуліновопротромбінового відношення: 1) При активації протромбіну плазми крові тромбопластином амідолітична активність тромбіну відповідає рівню лише функціонально активного протромбіну плазми крові; 2) При активації протромбіну плазми крові екамуліном (активатором протромбіну з отрути ефи багато лускової) амідолітична активність тромбіну вказує на сумарний рівень функціонально активного та декарбоксильованого протромбіну в досліджуваній плазмі крові. Рівень протромбіну, визначений з використанням екамуліну та тромбопластину, виражають як протромбінове та екамулінове відношення, що розраховують за відношенням амідолітичної активності досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності контрольної плазми крові у ступені, що характеризує чутливість активатора протромбіну. Екамуліново-протромбінове відношення визначають як відношення екамулінового та протромбінового відношень. Переваги тест-системи контролю ефективності лікування антикоагулянтами непрямої дії: - отримання інформації про рівень декарбоксильованого протромбіну в плазмі крові, поява якого є безпосереднім результатом впливу антикоагулянтів непрямої дії; - використання екамуліну забезпечує високу точність і відтворюваність результатів тесту оскільки він безпосередньо активує протромбін та його функціонально неактивні форми; - використання тромбін-специфічного хромогенного субстрату для визначення вмісту тромбіну, що утворюється за дії активаторів, нівелює вплив екзогенних та ендогенних інгібіторів системи гемостазу на результати тестів. Приклад 1 Для перевірки доцільності використання екамуліну для виявлення функціонально неактивних форм протромбіну в плазмі крові створюють модельну систему in vitro: в плазму крові позбавлену протромбіну додають виділені та очищені препарати протромбіну або претромбіну 1, який моделює функціонально неактивну форму протромбіну в кінцевих концентраціях 6,4мкг/мл. Для визначення амідолітичної активності тромбіну, що утворюється при дії активаторів, у планшетну лунку вносять 10мкл плазми крові, препарати: 20мкл екамуліну або тромбопластину, 10мкл 0,025М СаСl2, 185мкл 0,05М Трис-НСl бу 5 86856 феру, рН 7,4 з 0,13М NaCl та 25мкл 2мкМ тромбінспецифічного хромогенного субстрату S2238. Інкубують суміш 5 хвилин за температури 37°С, після чого визначають амідолітичну активність утвореного тромбіну спектрофотометрично при довжині хвилі 405-492нм. При дії екамуліну на донорську плазму крові з протромбіном та на плазму крові, де протромбін 6 замінений на претромбін 1 спостерігається однакова амідолітична активність. При дії препарату тромбопластину амідолітична активність спостерігається лише в донорській плазмі крові, що свідчить про нездатність тромбопластину активувати претромбін 1 (табл.1). Таблиця 1 Активація протромбіну та претромбіну 1 екамуліном та тромбопластином в плазмі крові (М±m, n=11) Модельна система Плазма крові з протромбіном Плазма крові, де протромбін замінений на претромбін 1 Показано, що екамулін активує як протромбін так і його функціонально неактивну форму, а тромбопластин здатен активувати лише протромбін. Тому порівняння результатів активації протромбіну плазми крові екамуліном та тромбопластином дозволяє встановити присутність в плазмі крові функціонально неактивних форм протромбіну, до яких належить PIVKA-протромбін. Приклад 2 В плазмі крові пацієнтів, яким проводилась терапія антикоагулянтами непрямої дії, визнача Амідолітична активність за дії екамуліну, % 100±7 Амідолітична активність за дії тромбопластину, % 100±9 81±5 6±0,5 ють амідолітичну активність тромбіну, що утворюється за дії тромбопластину та екамуліну, як описано в прикладі 1. Результати представляють у вигляді протромбінового відношення та екамулінового відношення. Для виявлення PIVKA- протромбіну в плазмі крові визначають екамуліновопротромбінове відношення (ЕПВ - відношення між екамуліновим та протромбіновим відношенням). Про накопичення PIVKA- протромбіну плазмі крові свідчить ЕПВ більше 1,2 (табл.2). Таблиця 2 Виявлення PIVKA-протромбіну в плазмі крові пацієнтів, яким проводилась терапія антикоагулянтами непрямої дії (M±SD) Хворі А Б В Г Протромбінове відношення (ПВ) 0,6 0,12 0,5 0,8 Приклад 3 Виявляють накопичення РІVKA-протромбіну, як описано в прикладі 2, до початку лікування антикоагулянтами непрямої дії, на піку лікування Екамулінове відношення (ЕВ) 0,9 09 1,0 0,8 ЕПВ 1,5 7,5 2 1 та після зниження дози антикоагулянтів. Порівняльний аналіз показує, що вміст PIVKAпротромбіну змінюється впродовж лікування антикоагулянтами непрямої дії (табл.3). Таблиця 3 Зміна вмісту PIVKA-протромбіну впродовж лікування антикоагулянтами непрямої дії № пацієнта 1 2 3 4 5 6 *р